丰树焕，张东铭，乐 婷，张苏河#，付艳芹

1)郑州大学第二附属医院内分泌科 郑州450014 2)郑州大学第二附属医院神经内科 郑州450014

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠期间首次发生的不同程度的糖代谢异常，可致母儿严重的并发症。GDM 是一种多因素疾病，其病因复杂，胰岛素抵抗和胰岛β 细胞凋亡是目前GDM 发病机制中研究较多的因素。内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是近年来1型、2 型糖尿病发病机制研究的热点，但在GDM 中研究较少。ERS 可促进胰岛素抵抗和β 细胞凋亡，蛋白激酶R 样内质网激酶(PERK)-C/EBP 同源蛋白(CHOP)作为ERS 经典的信号通路，在胰岛β 细胞凋亡中起关键作用［1］。作者通过观察GDM 模型大鼠胰腺组织中磷酸化PERK(p-PERK)及ATF4 蛋白活化的情况，并分析ATF4 与凋亡相关蛋白CHOP表达的相关性，了解p-PERK、ATF4、CHOP 蛋白活化在GDM 胰岛β 细胞凋亡发生中的作用。

1 材料与方法

1．1 实验动物及饲料 SPF 级健康雌性SD 大鼠30只购自河南省实验动物中心，平均周龄为4 周，平均体重为(110．8±14．9)g。普通饲料(标准啮齿类)和高脂高糖饲料［1］均购自河南省实验动物中心。

1．2 动物分组及GDM 大鼠模型建立 所有雌性SD 大鼠普通饲料适应性喂养1 周，时间标记为W1，按照随机数字表法分为2组:模型组和对照组，每组15只，分别给予高脂高糖饲料和普通饲料。喂养6周后，记为W7，按2∶1 与雄性SD 大鼠合笼，次晨阴道涂片镜检精子(+)计为孕1 d。标记并隔离孕鼠。合笼1 周后测定非空腹血糖，如血糖浓度≥6．7 mmol/L 则模型复制成功［2］，弃用未孕及血糖未达标大鼠，2组大鼠妊娠1 周后记为W9。

1．3 标本采集与方法

1．3．1 标本采集 妊娠第21天所有大鼠隔夜禁食12 h 后，体积分数10%水合氯醛腹腔麻醉，一侧颈动脉及对侧股静脉插管行静脉葡萄糖耐量(IVGTT)及静脉胰岛素释放实验(IVIRT)。结束后放血处死动物，快速分离胰腺组织，一部分置于甲醛溶液中固定，以备HE 染色、细胞凋亡及免疫组化检测使用;一部分置－80℃冰箱以备Western blot 使用。

1．3．2 HE 染色 取胰腺组织后常规石蜡包埋、切片，HE 染色后观察胰腺组织的病理组织学变化。

1．3．3 细胞凋亡检测 每只大鼠取切片1 张，按照凯基TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒进行操作。细胞核呈深棕色为染色阳性细胞，即为凋亡细胞。每张切片选取5个视野(×400)，分别计数凋亡细胞数和总细胞数，凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1．3．4 p-PERK 蛋白的检测 采用免疫组化SP法。石蜡包埋大鼠胰腺组织，2～3 μm 切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，PBS 冲洗3次，高压抗原修复5 min，自然冷却，PBS 冲洗3次，用二抗同源血清进行封闭，甩掉血清，滴加p-PERK 兔抗鼠多克隆一抗(稀释100 倍使用)(上海拜力生物科技有限公司)50 μL，室温下孵育1 h;滴加二抗50 μL，室温孵育15 min。DBA 显色，苏木素复染，脱水，透明及封片。

1．3．5 ATF4、CHOP 蛋白检测 采用Western blot方法。胰腺组织剪成小块，按每20 mg组织加100～200 μL 的比例加入蛋白裂解液，14 000 r/min ×5 min，取上清。BCA 法初步测定蛋白浓度。进行SDS-PAGE 电泳，每孔上样量30 μg，样品分离后转移至PVDF 膜，100 V 恒压1 h20 min，硝酸纤维素封闭，TBST 洗膜。分别加入ATF4、CHOP 一抗，4℃摇床孵育过夜，TBST 洗膜，加入二抗37℃孵育45 min，TBS 洗膜、蒸馏水漂洗后，ECL 显影，暗室压片。以β-actin 为内参对照。将胶片扫描后用Bandscan 5．0 软件进行灰度分析。

1．4 统计学处理 应用SPSS 20．0 处理数据，2组大鼠不同时间血糖和血胰岛素水平比较采用重复测量数据的方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。2组大鼠胰腺组织中p-PERK、ATF4、CHOP 蛋白表达水平的比较采用两独立样本t 检验。模型组大鼠胰腺组织中ATF4 和CHOP 蛋白的相关性采用直线相关分析。检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 2组大鼠不同时间血糖值比较 2组大鼠适应性喂养1 周后，血糖值无显著差异，对应饲料喂养6周后，模型组大鼠的血糖值高于对照组;妊娠1 周后，模型组大鼠血糖值高于对照组，见表1。

表1 2组大鼠不同时间血糖值比较 mmol/L

2．2 2组大鼠妊娠第21天时血糖和血胰岛素水平比较 模型组大鼠第一时相胰岛素分泌受抑制，胰岛素分泌峰值延迟。见表2。

表2 2组大鼠妊娠第21天时的血糖、血胰岛素值比较

2．3 2组大鼠胰腺病理组织学观察 对照组胰岛形态尚规则，有少许出血发生，可见少许空泡变性发生;模型组胰岛形态欠规则，胰岛数目减少不明显，细胞排列紊乱，部分细胞呈空泡变性，出现核固缩和裂解，可见以淋巴细胞、单核细胞为主的炎细胞浸润，可见毛细血管扩张、充血，有出血发生，见图1。

图1 2组大鼠胰腺病理组织学观察(HE，×400)

2．4 2组大鼠胰腺组织中细胞凋亡水平 2组大鼠胰腺细胞凋亡情况见图2。模型组大鼠细胞凋亡率［(18．55 ±1．29)%］较对照组［(8．47 ±0．78)%］升高(t=21．164，P＜0．001)。

图2 2组大鼠胰腺细胞凋亡情况(TUNEL，×400)

2．5 2组大鼠胰腺组织中p-PERK 蛋白的表达对照组大鼠胰腺组织p-PERK 蛋白的表达水平为(0．297 ±0．010)，低于模型组的(0．615 ±0．020)(t=44．178，P＜0．001)。见图3。

图3 2组大鼠胰腺组织p-PERK 蛋白的表达情况(SP，×400)

2．6 2组大鼠胰腺组织中ATF4 及CHOP 蛋白的表达 见图4。与对照组相比，模型组大鼠胰腺组织中ATF4 蛋白和凋亡蛋白CHOP 的表达水平分别为(0．57 ± 0．02)和(0．51 ± 0．03)，高于对照组 的(0．18±0．03)和(0．22 ±0．04)(t =49．249 和39．664，P＜0．001)。模型组大鼠胰腺组织中ATF4 和CHOP蛋白的表达呈正相关(r=0．810，P=0．004)。

图4 2组大鼠胰腺组织中ATF4 和CHOP 蛋白的表达

3 讨论

由于需要合成和分泌大量的胰岛素，β 细胞具有一系列独特的功能，其中之一就是具有高度发达的内质网(endoplasmic reticulum，ER)，后者是蛋白质生物合成、折叠及运输的重要细胞器，也是钙离子的储存库。当各种刺激引起未折叠或错误折叠的蛋白质在ER 蓄积，机体将启动保护性机制即未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，简言之，UPR 通过减少新合成蛋白质向ER 运输或增加蛋白折叠能力，最终恢复细胞稳态。然而，如刺激因素持续存在，将激活凋亡通路进而导致β 细胞凋亡，这种转变称为ERS［3-4］。已有研究［5-6］证明ERS 诱导的细胞凋亡与多种疾病密切相关，如肥胖、糖尿病、神经退行性病变、缺血性疾病、肿瘤等。目前广泛接受的与ERS 凋亡相关的通路包括:IRE1α 诱导的细胞凋亡相关通路及CHOP 诱导的细胞凋亡相关通路，后者在各型糖尿病中均有研究，但在GDM 中研究较少。

PERK 是ER 膜上的一种Ⅰ型跨膜蛋白，当ERS发生时，PERK 通过寡聚化和自身磷酸化，进而抑制真核生物翻译起始因子eIF2α 的磷酸化，即可以抑制几乎所有的mRNA 的转录，然而却可以诱导如ATF4 mRNA 的翻译，ATF4 继而调控ATF3、CHOP和Tribbles 同源蛋白3 的表达［7］，进而导致细胞凋亡的发生。ERS 时，PERK、IRE1 和ATF6 都能诱导CHOP 的转录，PERK-eIF2α-ATF4 是CHOP 蛋白所必需的［8］。Eizirik 等［9］在糖尿病动物模型中发现，CHOP 基因敲除的Akita 小鼠ERS 诱导的β 细胞凋亡减少，从而延迟糖尿病的发生，因此，CHOP 是持续性ERS 诱导程序性细胞死亡的关键启动因子和标志物。

该研究结果中IVGTT 及IVIRT 结果反映出模型组大鼠第一时相胰岛素分泌受抑，胰岛素延迟释放;β 细胞凋亡率较对照组升高，提示高脂高糖饮食可致胰岛β 细胞功能障碍，进而导致细胞凋亡的发生。胰腺病理组织学观察发现模型组有空泡变性，提示高脂高糖对胰岛有损害作用。在高血糖刺激下，β 细胞仍能分泌较多的胰岛素以满足需要，表现为血胰岛素水平升高。但长期高脂饮食对胰岛毕竟有损害，故表现为β 细胞分泌胰岛素能力相对不足。胰腺组织p-PERK 蛋白在模型组大鼠表达明显增加，说明高脂高糖饮食可以诱导ERS 的发生。模型组大鼠胰腺组织ATF4、CHOP 蛋白表达均升高，且ATF4 与CHOP 蛋白表达呈正相关，ATF4 诱导下游CHOP 蛋白表达升高是细胞由自噬转向凋亡的关键环节，与Matsumoto 等［10］的研究结果一致。

综上所述，可以认为高脂高糖饮食诱导ERS 的发生，PERK-ATF4-CHOP 通路被激活，PERK 通路的活化与GDM β 细胞凋亡密切相关，CHOP 基因的过度表达可能在β 细胞凋亡中起着关键作用。

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