李 黎，张丽华#，李 凌，李小威，简立国

1)郑州大学第二附属医院心血管内科 郑州450014 2)郑州大学第一附属医院心血管内科 郑州450052

心肌梗死后心室重构是决定心肌梗死患者心功能情况及预后的重要因素，因此，预防和治疗心肌梗死后心室重构已成为医学研究的热点。他汀类药物不仅具有调脂作用，亦存在改善和逆转心室重构的作用。近年的研究［1］显示miRNA-21 参与了梗死后心肌纤维化和心脏重构的调控。该研究通过观察阿托伐他汀治疗前后急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)大鼠心功能及梗死心肌周边区MMP-9 mRNA 和miRNA-21 表达的变化，探讨两者与心肌梗死后心室重构的相关性，以及他汀类药物对心室重构的影响及可能的机制，为临床应用提供新的实验依据。

1 材料与方法

1．1 实验动物 48只健康雄性Wistar 大鼠，体重(250 ±20)g，月龄(3．2 ±0．5)个月，购于郑州大学实验动物中心，合格证号:410121。

1．2 主要实验器材和试剂 小动物呼吸机(江西特力麻醉呼吸设备公司)，Vivid 7 超声心动仪(GE公司)，显微镜、彩色病理图像分析系统、石蜡切片机(德国蔡司公司)，MFL Lab200 心功能记录仪;阿托伐他汀片(美国辉瑞公司);Trizol 试剂盒(Invitrogen 公司)，大鼠MMP-9、内参β-actin 引物及miRNA-21、内参U6 引物序列见表1，ALL-in-One miRNA PCR 检测试剂盒(GeneCoporia 公司)，MMP-9 ELISA检测试剂盒(北京方程生物科技有限公司)。

表1 引物序列

1．3 AMI 模型制备方法 参照文献［2］结扎大鼠冠状动脉前降支建立AMI 模型。大鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰卧位固定，气管插管，连接小动物呼吸机及多道生理信号采集处理系统;在左侧第3 肋间开胸后暴露心脏，结扎左冠状动脉前降支。心电图提示Ⅰ和avL 导联ST 段较基线上抬＞0．2 mV 为手术成功。术后注射青霉素20 万U/kg 常规抗感染治疗7 d。

1．4 实验分组 采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组、阿托伐他汀低剂量组和阿托伐他汀高剂量组，每组12只。假手术组仅穿线不结扎，余3组均制备AMI 模型。术后24 h 开始，阿托伐他汀低、高剂量组分别按20、40 mg/(kg·d)的剂量灌胃阿托伐他汀蒸馏水溶液，其余两组灌胃等量蒸馏水，共6 周。

1．5 观测指标

1．5．1 超声心动图 6 周后，将实验大鼠称重麻醉后，应用超声心动仪检测大鼠心脏形态和功能。测量参数包括:室间隔厚度、左室后壁舒张末期厚度、左心室收缩末期内径、左心室舒张末期内径，计算左心室射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)及E/A 比值。

1．5．2 血浆MMP-9 水平 6 周后于大鼠颈静脉窦取血1 mL，分离血清并置于－40℃冰箱中保存，采用ELISA 法检测血浆MMP-9 水平。

1．5．3 左心室形态学 超声心动图检测完成后，处死大鼠，开胸取出心脏，待心腔中的血液排净后，去除多余脂肪组织以及左、右心房和右心室，称取左心室质量，计算大鼠左室质量指数(LVMI)，LVMI =左心室质量/体重。

1．5．4 心肌胶原容积分数(CVF) 在乳头肌横切面切取大鼠心肌组织，经福尔马林溶液固定后，常规脱水、透明、石蜡包埋，切取厚4～5 μm组织切片。应用彩色病理图像分析系统进行拍照，通过灰度调节区分胶原和非胶原成分，应用天狼星红染色。CVF 即心肌胶原面积/所测同视野组织总面积。每张切片选取10个不重复的视野测定CVF，取平均值。

1．5．5 大鼠梗死心肌周边区miRNA-21、MMP-9 mRNA 的表达 采用RT-PCR 法检测。取梗死心肌及周边组织，参照Trizol 试剂盒说明书提取总RNA，进一步合成cDNA，以cDNA 为模板进行PCR。MMP-9 反应条件:94℃5 min;94℃45 s;57℃45 s;72℃45 s，共34个循环。miRNA-21 反应条件:94℃2 min;94℃20 s，60℃30 s，72℃30 s，40个循环。用凝胶扫描成像系统进行成像处理。分别以β-actin、U6 为内参照，计算MMP-9 mRNA、miRNA-21 的相对表达量。

1．6 统计学处理 应用SPSS 13．0 进行分析，各组心脏形态和心功能参数、心肌CVF、血浆MMP-9 水平及梗死周边区心肌组织中MMP-9 mRNA 和miRNA-21 表达水平的比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，miRNA-21、MMP-9 mRNA 和CVF 间的关系采用Pearson 线性相关分析，检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 4组大鼠心脏形态和心功能参数的比较 见表2。与假手术组比较，模型组LVMI、左心室收缩末期内径、舒张末期内径均显著增加，室间隔厚度、左心室后壁舒张末期厚度、EF、FS 显著降低;而阿托伐他汀治疗组LVMI、左心室收缩末期内径、舒张末期内径较模型组降低，室间隔厚度、左心室后壁舒张末期厚度、EF、FS 及E/A 显著增加。

表2 4组大鼠心脏形态和心功能参数的比较

2．2 4组大鼠心肌CVF 及血浆MMP-9 水平的比较 见图1、表3。与假手术组比较，模型组大鼠心肌CVF 和血浆MMP-9 水平显著升高(P＜0．05);与模型组比较，阿托伐他汀治疗组大鼠心肌CVF 和血浆MMP-9 水平均明显降低(P＜0．05)，低剂量组和高剂量组相比差异无统计学意义(P ＞0．05)。

图1 4组大鼠心肌胶原检测(×200)

表3 4组大鼠心肌CVF 和血浆MMP-9 水平的比较

2．3 4组大鼠梗死周边区心肌组织MMP-9 mRNA和miRNA-21 相对表达量的比较 见图2、表4。与假手术组比较，模型组梗死周边区MMP-9 mRNA 和miRNA-21 表达水平升高(P＜0．05);与模型组比较，阿托伐他汀组心肌梗死周边区MMP-9 mRNA 和miRNA-21 降低(P＜0．05)，但仍高于假手术组(P＜0．05)。

图2 4组大鼠梗死周边区心肌组织MMP-9 mRNA 和miRNA-21 的表达

表4 4组大鼠梗死周边区心肌组织MMP-9 mRNA 和miRNA-21 相对表达量的比较

2．4 各指标相关性分析 模型组、阿托伐他汀低剂量组、阿托伐他汀高剂量组梗死周边区miRNA-21与MMP-9 mRNA 表达水平呈正相关(r 分别为0．613、0．512 和0．551，P 分别为0．033、0．031 和0．035)，miNAR-21 表达水平与CVF 呈正相关(r 分别为0．518、0．528 和0．575，P 分别为0．046、0．027和0．022)，MMP-9 mRNA 表达水平与CVF 呈正相关(r分别为0．540、0．565 和0．612，P分别为0．029、0．029和0．033)。

3 讨论

心肌梗死后心室重构是决定心肌梗死患者心功能及预后的主要因素。心室重构包括细胞和基质改变，其中细胞改变主要表现为细胞生长异常、凋亡和坏死，坏死的心肌细胞逐渐被增生的基质取代，最终导致心室重构。而基质的改变主要表现为心肌细胞外基质成分、结构的变化以及不同基质成分合成与降解比例的失衡。MMP-9 是基质金属蛋白酶家族中的一个重要成员，能够降解Ⅳ型胶原等多种细胞外基质成分。动物实验和临床研究［3-6］发现，急性心肌梗死后早期MMP-9 即被激活，并且在随后的心室重构期间表达持续升高;MMP-9 表达上调一方面可引起心脏胶原降解亢进，另一方面，可引起梗死周边区炎症细胞的浸润，最终导致AMT 后心室重构、室壁瘤形成以及心脏破裂。MMP-9 基因敲除的大鼠发生心肌梗死后，梗死区胶原蛋白降解减少，左室进行性扩大得以延缓［7］。早期应用MMP 抑制剂能改善心肌梗死大鼠左室功能，减轻心室重构［8］。该研究发现，AMI 大鼠LVMI、左心室舒张和收缩末期内径、心肌CVF 均显著增加，EF、FS 显著降低，MMP-9 表达明显增加，提示AMI 后大鼠心肌组织细胞外基质发生改变，出现纤维化，胶原比例失调，出现了心室重构;MMP-9 参与了早期的心室重构。

miRNA 是一种在生物学上高度保守的短链RNA 分子。miRNA 可通过与靶mRNA 结合，对基因进行表达后转录调控，参与疾病的病理生理过程。近年来的研究发现，miRNA-21 在缩小心肌梗死范围［9-10］、促进心脏肥大［11］、诱导新生血管内膜形成［12］及影响心肌纤维化［13］等方面发挥重要作用。Roy 等［14］的研究表明，心脏缺血再灌注损伤可以诱导鼠心肌细胞miRNA-21 表达上调，而miRNA-21 可以通过抑制PTEN 的表达，促进Akt 磷酸化，从而导致成纤维细胞MMPs 表达增加，促进心肌纤维化和心脏重构。该研究证实，与假手术组相比，模型组大鼠梗死周边区miRNA-21 表达水平明显升高，表达水平与MMP-9 mRNA 水平以及心肌CVF 呈正相关，说明梗死周边区存在心肌成纤维细胞的增殖和纤维化，miRNA-21 参与了心肌纤维化的过程。miRNA-21 的促心肌纤维化作用可能与MMP-9 表达上调有关。

他汀类药物不仅具有调脂作用，也具有心血管保护作用，包括改善血管内皮功能、抗氧化、抑制炎症反应等［15-16］，因此对于他汀类药物的多效性研究也是近年来的热点。研究［17］证实，他汀类药物能抑制AMI 后的左室重构，改善心脏收缩和舒张功能，其作用机制可能在于:①阻断甲羟戊酸途径，减少AngⅡ的生成，降低AT1 受体密度及AT1 受体mRNA 表达，从而抑制RAS。②抑制炎症性细胞因子(如TNF-α、IL-6 等)的生成，从而抑制心肌细胞肥大及凋亡。③抑制心脏胶原合成及其mRNA 的表达，使胶原增生和沉积减少，延缓心室顺应性的下降［18］。④动态调节MMPs 转录和降解水平，防止心肌纤维化及心脏重构［19］。⑤激活蛋白激酶Akt 以及PPARs，增加NO 合成，减少ET-1 分泌，抑制心室肥厚。该研究中阿托伐他汀治疗组LVMI、心肌CVF显著低于模型组，梗死周边区MMP-9 mRNA 和mi-NAR-21 的表达、血浆MMP-9 水平亦显著低于模型组，说明阿托伐他汀能够减轻模型大鼠的心肌纤维化，改善左室重构。

该研究结果表明，他汀类药物可通过下调miRNA-21 表达，进而影响MMP-9 的表达，从而发挥抗心肌纤维化、改善左室重构的作用。但阿托伐他汀降低梗死周边区miRNA-21 表达、减轻心肌纤维化的具体机制，还有待进一步的探讨。

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