张建波，吕晓东，宋 巍，孙淼淼，于庆凯，冯 稳，刘明阁，胡 骏，房百俊

1)郑州大学附属肿瘤医院病理科 郑州450003 2)郑州大学附属肿瘤医院中心实验室 郑州450003 3)中山大学中山医学院微生物学教研室 广州510089 4)郑州大学附属肿瘤医院血液科 郑州450003

T 细胞在抗肿瘤免疫中起重要作用，并以识别肿瘤相关抗原的T 细胞克隆性增生为特点［1］。研究［2］证实多种实体瘤患者体内存在针对肿瘤抗原特异反应的T 细胞克隆，分析这些克隆性增生的T细胞对于了解机体抗肿瘤的免疫状态以及开展特异性免疫治疗有重要意义。该研究旨在分析乳癌患者转移淋巴结中T 细胞的克隆性增生及T 细胞受体(T cell receptor，TCR)β 链互补决定区3(complementarity determining region 3，CDR3)亚家族基因谱型及氨基酸序列特点，为寻找乳癌患者肿瘤相关抗原表位及个体化免疫治疗等打下基础。

1 材料与方法

1．1 标本 郑州大学附属肿瘤医院确诊为乳腺浸润性导管癌(组织学Ⅱ级)的住院患者5例，均为女性，年龄28～73岁，取其经术中快速冰冻病理检查明确有癌微转移的腋窝前哨淋巴结标本。同时取2例乳腺反应性增生患者的淋巴结标本作为对照。该研究经郑州大学附属肿瘤医院伦理委员会批准。

1．2 主要试剂 Trizol 试剂、SuperScript Ⅲ逆转录酶、SMART 引物、LD PCR 引物ⅡA 购自美国Invitrogen 公司，Advantage 2 Polymerase Mix 购自美国BD Biosciences Clontech 公司，Taq DNA 聚合酶购自美国Promega 公司，胶纯化试剂盒购自美国Omega Biotek 公司。

1．3 RNA 提取及cDNA 合成 将癌转移淋巴结及对照淋巴结的新鲜标本在200 目筛网上研磨后用PBS 冲洗，收集细胞悬液，加入1 mL 无血清RPMI 1640 培养液并计数。用Trizol 试剂提取总RNA，在SuperScript Ⅲ逆转录酶及SMART 引物作用下合成cDNA，在LD PCR 引物ⅡA 作用下合成cDNA 第2 链。

1．4 24个TCR β 链可变区(BV)亚家族的扩增根据文献［3］设计24个TCR BV 亚家族上游引物，并在β 链恒定区(C 区)设计一条共用的FAM 标记的下游引物和对照引物，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。总反应体系为50 μL，反应条件为:94℃预变性3 min;94℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，35个循环;72℃延伸10 min。取7 μL PCR 反应产物在15 g/L 琼脂糖凝胶中电泳。

1．5 基因扫描分析 取5 μL 荧光引物扩增的TCR BV 各亚家族PCR 产物与3 μL DNA 变性胶上样缓冲液混合，加入0．5 μL 标准品。94℃4 min 后上样至60 g/L 聚丙烯酰胺凝胶，于373 DNA 序列分析仪(ABI，Perkin Elmer)中电泳，计算机收集电泳过程中出现的不同颜色和强度的荧光素，用GeneScan 672软件进行基因扫描分析。

1．6 序列分析 将GeneScan 扫描分析提示单克隆或寡克隆增生的cDNA 重新进行PCR 扩增(条件同1．4)，上游引物不变，下游引物改为未用FAM 标记的C 区引物。PCR 产物经纯化回收后送上海英骏生物技术有限公司测序，利用DNAstar 软件及网上TCR 资源(http://imgt．cines．fr/)进行序列分析。

2 结果

2．1 两种淋巴结TCR BV 各亚家族RT-PCR 扩增结果 RT-PCR 扩增结果显示对照淋巴结全部24个BV 亚家族均有扩增。乳癌病例1、2、4 的转移淋巴结中24个BV 亚家族均有扩增，病例3 的BV7 家族和病例5 的BV13、BV16 家族无扩增，其余家族均有扩增，病例5 的24个TCR BV 亚家族的扩增结果见图1。

图1 病例5 的24个TCR BV 亚家族PCR 扩增结果

2．2 两种淋巴结TCR BV 亚家族基因扫描结果2例对照淋巴结各BV 亚家族均有表达，基因扫描均呈中间高两边低、多个峰的谱型，提示为多克隆。乳癌病例1 的BV2、病例2 的BV4 扫描分析结果为单一主峰和少数小峰图像，提示为寡克隆增生;病例3的BV18、病例4 的BV14、病例5 的BV2 和BV19 为单一主峰即单克隆增生，其余BV 亚家族为寡克隆趋势和多克隆增生。5例乳癌患者T 细胞部分TCR BV 亚家族T 细胞克隆性特点见表1，其余亚家族均为多克隆表达。

表1 5例乳癌患者部分TCR BV 亚家族T 细胞克隆性特点

2．3 TCR β 链CDR3 序列测定结果 乳癌患者单克隆及寡克隆增生T 细胞TCR β 链CDR3 区核苷酸及氨基酸序列见表2。不同病例限制性取用的BV 亚家族不同，病例1 和病例5 均取用了BV2 家族，但其核苷酸序列不同。各亚家族CDR3 区序列长度为30～45 bp。

表2 乳癌患者T 细胞TCR BV 亚家族β 链限制性取用和CDR3 区核苷酸及氨基酸序列测定结果

3 讨论

T 细胞通过TCR 识别肿瘤细胞相关抗原，在机体抗肿瘤免疫反应中起着重要作用［4］。肿瘤患者浸润淋巴细胞中存在针对肿瘤抗原的特异性增生T细胞克隆。不同克隆T 细胞的TCR 重排时，V-D-J基因片段重排和随机插入核苷酸形成一高度可变区，称为CDR3，是TCR 特异识别抗原的区域。CDR3 长度及碱基序列的不同形成了T 细胞表面多种多样的TCR CDR3 基因谱型［5］。分析CDR3 基因谱型是一种独特的检测T 细胞克隆性的方法。PCR-基因扫描-序列分析方法通过检测CDR3 的长度是否相同以确定T 细胞的克隆性，然后对出现单克隆或寡克隆的PCR 产物进行序列分析，从而了解其CDR3 的核苷酸序列，是检测T 细胞克隆性较为理想的方法［6］。

作者利用该方法分析了5例乳腺浸润性导管癌(组织学Ⅱ级)患者转移淋巴结内克隆性增生T 细胞。与乳腺反应性增生患者T 淋巴细胞表达全部(24个)TCR BV 亚家族不同，乳癌患者TCR BV 亚家族表达存在明显的限制性取用，每例患者均出现一个或多个TCR BV 亚家族的谱型偏移，表明乳癌患者转移淋巴结内存在针对乳癌细胞释放的肿瘤相关抗原的特异免疫反应性T 细胞克隆性增生，而且这些优势克隆性增生的T 细胞会影响其他家族T细胞的表达。5例患者选择性表达的TCR BV 亚家族亦不同，分析其原因可能为:乳癌肿瘤相关抗原具有复杂性和多样性，不同的抗原表位可诱发机体产生针对性的BV 亚家族优势表达，同时也与不同患者之间人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)型别存在差异、疾病病程的不同阶段TCR 取用情况不同等有关［7］。该研究中2例乳腺浸润性导管癌患者均表达了BV2 亚家族，是否BV2 亚家族T细胞克隆是乳腺浸润性导管癌肿瘤相关抗原的特异性效应T 细胞克隆，有待进一步研究。基因扫描结果显示，5例乳腺浸润性导管癌患者大部分BV 亚家族基因呈多克隆表达，这是因为病变淋巴结中仍存在一些正常BV 亚家族T 细胞，而且T 细胞对肿瘤相关抗原的反应性克隆性增生也处于一个动态过程中。虽然病例1 和病例5 的3个克隆产物CDR3 序列长度相同，但其氨基酸序列完全不同，证实为不同的T 细胞克隆。有研究［7］提示TCR 识别抗原时，除HLA 型外，TCR CDR3 本身的结构和空间构型也有影响，不同谱型的CDR3 如果空间结构相似很可能会识别相同的抗原表位［8］，因此有必要对该研究中不同患者之间多样性的CDR3 谱型进行生物信息学分析，了解其是否具有相似的空间结构。

乳癌患者体内存在T 细胞的克隆性增生，一方面说明T 细胞参与了机体的抗肿瘤免疫应答反应，可考虑采用特异性的TCR β 链单克隆抗体活化肿瘤自体T 细胞，获得临床治疗数量的特异性细胞毒T 细胞，用于乳癌患者的个体化免疫治疗;另一方面也说明了机体内存在诱导T 细胞克隆性增生的肿瘤相关抗原。因此，监测乳癌根治术后患者体内T细胞克隆性增生情况，可为分析患者是否有微小肿瘤残留及肿瘤复发提供依据和对比指标［9］。

总之，该研究分析了5例乳癌患者转移淋巴结标本中TCR β 链谱型偏移，表明患者体内存在T 细胞的克隆性增生，有助于了解患者的细胞免疫功能状态。进一步的CDR3 氨基酸序列分析既证实克隆性增生T 细胞来自不同的T 细胞群，也为分析乳癌肿瘤相关抗原表位、疫苗研制，进行个体化免疫治疗等提供了帮助。

［1］He XY，Yang WM，Tang WT，et al．TRAV gene expression in PBMCs and TILs in patients with breast cancer analyzed by a DNA melting curve(FQ-PCR)technique for TCR α chain CDR3 spectratyping［J］．Neoplasma，2012，59(6):693

［2］Sherwood AM，Emerson RO，Scherer D，et al．Tumor-infiltrating lymphocytes in colorectal tumors display a diversity of T cell receptor sequences that differ from the T cells in adjacent mucosal tissue［J］．Cancer Immunol Immunother，2013，62(9):1453

［3］姚新生，马骊，温茜，等．监测TCR CDR3 漂移的免疫扫描谱型分析技术的建立与鉴定［J］．中华微生物学和免疫学杂志，2006，26(6):571

［4］吴亚红，高艳锋，祁元明．肿瘤抗原细胞毒性T 淋巴细胞表位鉴定和多肽疫苗的研究进展［J］．郑州大学学报:医学版，2011，46(5):657

［5］Sainz-Perez A，Lim A，Lemercier B，et al．The T-cell receptor repertoire of tumor-infiltrating regulatory T lymphocytes is skewed toward public sequences［J］．Cancer Res，2012，72(14):3557

［6］Blohm JH，Blohm N，Hummel M，et al．Detection of clonal T-cell-receptor(TCR)Vbeta rearrangements in explanted dilated cardiomyopathy hearts by semi-nested PCR，GeneScan，and direct sequencing［J］．Med Sci Monit Basic Res，2013，19:111

［7］Luo W，Liao WJ，Huang YT，et al．Cancer of the gastrointestinal tract results in a restricted T-cell repertoire dependent upon tumor differentiation［J］．Cell Immunol，2011，270(1):47

［8］尹青松，谭获，陈少华，等．抗原特异TCRα 和β 链基因克隆及分子空间结构预测［J］．第三军医大学学报，2011，33(4):349

［9］Boone E，Verhaaf B，Langerak AW．PCR-based analysis of rearranged immunoglobulin or T-cell receptor genes by GeneScan analysis or heteroduplex analysis for clonality assessment in lymphoma diagnostics［J］．Methods Mol Biol，2013，971:65