张德辉，孙亚丽，赵 亮，丑敏霞（西北农林科技大学生命科学学院，旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 712100）

天蓝苜蓿锌胁迫下实时定量PCR内参基因筛选

张德辉，孙亚丽，赵 亮，丑敏霞*（西北农林科技大学生命科学学院，旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 712100）

选取8个管家基因（h2a、act、18s、tub、ubi、ef1、cyp、gapdh）作为候选内参基因，以不同浓度Zn2+处理下接菌第30d的天蓝苜蓿（Medicago Lupulina L.）接种根为实验材料，筛选用于目的基因实时荧光定量PCR分析的最佳内参基因.研究表明：候选内参基因平均表达稳定性由高到低排序为：ef1＞ubi＞act＞h2a＞gapdh＞cyp＞18s＞tub；在不同Zn2+浓度胁迫下，最适内参基因组合各不相同：Zn2+=100mg/kg时，最佳内参基因组合为tub （1.97）和ef1 （2.06）； Zn2+=200mg/kg时，最佳内参基因组合为ef1 （1.41）和ubi （2.51）； Zn2+=300mg/kg时，最佳内参基因组合为ef1 （1.41）和h2a （2.78）； Zn2+=400mg/kg时，最佳内参基因组合为ef1 （2.45）和act （2.55）.该研究可为重金属污染地天蓝苜蓿抗性基因和共生基因的表达分析提供理论依据.

天蓝苜蓿；接种根；内参基因；实时荧光定量PCR；锌

土壤是人类赖以生存的主要资源之一，随着工业经济的发展，土壤污染尤其是重金属污染尤为突出［1-2］，而某些微生物、植物与微生物共生体对重金属污染土壤的修复发挥着重要作用［3］.重金属污染的土壤，氮素不足是限制植被恢复的关键因子之一，因此提高重金属污染土壤中氮素水平成为生态修复的首要工作［4］.豆科植物---根瘤菌的共生体系因其卓越的固氮能力，常作为尾矿地环境修复的先锋植物.

目前，许多国家都非常重视重金属耐性豆科植物的选择和根瘤菌的研究以及利用豆科植物根瘤菌共生体系进行重金属污染地修复的实践. Piha等［5］在Sn矿尾矿地进行植被重建的试验研究显示，豆科植物具有良好的成活率和较好的生长速度；他同时指出，耐性豆科植物可以与根瘤菌共生而克服废弃地瘦瘠所带来的障碍.Jha等［6］利用豆科灌木修复石灰石采石场废弃地及Smyth等［7］利用豆科植物修复煤矿废弃地，所有这些实践都是非常成功的.豆科植物分子水平抗性基因、共生基因的筛选及其功能研究受到广泛关注［8-9］.利用豆科植物---根瘤菌共生固氮作用在重金属污染的尾矿废弃地土壤植被修复和生态重建的研究也日趋成熟，这也为污染土壤重金属控制和修复提供了较为完整的理论和实践基础.

近年来，对植物内参基因的筛选已有众多报道［10-12］，但对豆科植物内参基因筛选只有花生、黑吉豆等［13-14］少数报道.大多数内参基因筛选局限在不同时期不同组织、生物胁迫以及非生物胁迫中干旱和盐胁迫样本，对于豆科植物在重金属胁迫下内参基因的筛选鲜有报道.然而对于这方面的研究，将有助于对豆科植物抗性基因、共生基因的表达研究.

实时定量PCR（qRT-PCR）具有灵敏度高、定量准确、特异性等特点，已广泛应用于基因的表达分析［15］.利用qRT-PCR分析目的基因表达时，一个好的内参基因可以消除RNA提取质量以及反转录效率等所带来的背景误差［16-17］，因此筛选特定背景下最适内参基因对目的基因表达分析至关重要.

本研究选取选取8个管家基因作为候选内参基因：组蛋白基因（Histone H2A，h2a）、肌动蛋白基因（Actin，act）、18S核糖体RNA基因（18S ribosomal RNA，18s）、β-微管蛋白基因（Tubulin beta chain，tub）、泛素蛋白基因（Ubiquitin，ubi）、延伸因子-1α基因（Elongation factor 1-alpha，ef1）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gapdh）、亲环蛋白基因（cyclophilin，cyp）.管家基因编码蛋白不仅是细胞器骨架基本组分（actin、tub）、真核生物染色体基本结构蛋白（h2a）和广泛存在于原核和真核生物中的胞浆蛋白（cyp），还参与生物体的基本代谢过程（gapdh、ef1、ubi），因此，理论上管家基因在生物体内都是稳定表达的.此外，18S核糖体RNA调控合成独立于信使RNA，因此核糖体RNA的转录表达较为稳定，常被用作内参基因来校正目的基因的表达.

本实验对不同Zn2+浓度处理下天蓝苜蓿接种根实验数据分析筛选最适内参基因组合，为重金属污染土壤修复过程中抗性基因、共生基因的表达分析提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

供试天蓝苜蓿（Medicago Lupulina L.）种子和苜蓿中华根瘤菌CCNWSX0020（Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020）（该菌具有良好的锌抗性）均由本实验室提供.

1.2 方法

1.2.1 天蓝苜蓿种植及样品采集 天蓝苜蓿种子脱皮，无菌水冲洗6～8次，95%（V/V）酒精浸泡1min，30%（V/V））NaClO处理2min，最后用无菌水冲洗6～8次用于播种.播种前，每个花盆装入200g基质（蛭石与珍珠岩按体积比为2：1形式充分混匀），121℃灭菌1h；实验组加入不同浓度的硫酸锌（Zn2+浓度：100， 200， 300， 400mg/kg）模拟锌污染.光照培养：将花盆置于智能植物培养箱，培养箱参数为：16h光照/8h黑暗，温度为（24±2）℃，湿度为40%，光照强度为4级.当幼苗长出第一片真叶，接种根瘤菌CCNWSX0020，期间无氮营养液［18］和无菌水交替浇水，取接菌后30d天蓝苜蓿共生根于液氮迅速冷冻后置于-80℃保存用于RNA提取（每组样品重复3次）.

1.2.2 总RNA提取与cDNA合成 利用RNAiso Plus试剂盒（TaRaKa公司）提取RNA，提取流程按照说明书进行.对所提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测（OD260/280= 1.8～2.0， OD260/230＞2.0）.利用PrimeScript®RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（TaRaKa公司）将提取的RNA（0.5μg）按照说明书合成cDNA置于-20℃保存备用.

1.2.3 引物设计及其特异性检测 本研究选取8个功能不同的管家基因：h2a、act、18s、tub、ubi、ef1、gapdh、cyp作为候选内参基因.利用Primer5.0软件参考蒺藜苜蓿相关基因cDNA序列设计引物.引物特异性检测：不同浓度Zn处理样品cDNA等量混合，普通PCR扩增候选内参基因琼脂糖凝胶电泳检测并送上海英潍捷基公司测序.qRT-PCR分析溶解曲线.

1.2.4 荧光定量PCR分析及扩增效率检测 反转录产物cDNA稀释10倍，使用SYBR®Primix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）试剂盒（TaKaRa公司）用于qRT-PCR反应.各内参基因的荧光定量反应在CFX 96TMRealTime System（Bio-Rad）荧光定量仪上进行.反应体系为20μL，其中SYBR®Primix Ex TaqTM（2×）10μL，ddH2O 5.4μL，cDNA模板3μL，上、下游引物（10mmol/L）各0.8μL.反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性5s；60℃退火30s；72℃延伸30s；39个循环.

引物扩增效率检测：所有样品cDNA等量混合用于PCR扩增，扩增产物稀释104后，依次稀释5， 52， 53， 54， 55倍用于qRT-PCR扩增，制作标准曲线并计算引物扩增效率.

1.2.5 Cycle threshold（Ct）值比较 对各候选内参基因在所有样品中Ct值比较分析，通过SigmaPlot 10.0软件作图，得出各候选内参基因在样品中Ct值分布范围，反映各候选内参基因在综合胁迫下平均表达水平.比较同一候选内参基因在不同Zn2+浓度处理样品中Ct值变化，反映各候选内参基因在不同样品中的相对表达量.

1.2.6 候选内参基因稳定性分析 通过在线评估内参基因稳定性工具（http：//www.leonxie. com/referencegene.php）分析候选内参基因的稳定性［19］.该在线工具集合了the comparativeΔCt method［20］， BestKeeper［21］， NormFinder［22］和geNorm［23］4个稳定性评估软件；此外，该在线工具对以上4个软件计算结果进行综合分析，得到各候选内参基因综合排名.

1.2.7 评价候选内参基因最适数目 候选内参基因最适数目通过geNorm软件计算基因的配对变异值Vn/n+1确定内参基因的最适数目.利用geNorm软件计算n个基因作为内参基因得出的标准化因子与n+1个基因作为内参基因得出的标准化因子的配对变异值Vn/n+1.一般认为当Vn/n+1＜0.15时，表明研究目的基因表达过程中使用n个内参基因可以得到准确结果，没有必要引入第n+1个内参基因.

2 结果与分析

2.1 引物特异性及扩增效率检测

凝胶电泳检测普通PCR扩增产物，结果显示：只有特异性扩增条带，无其它杂带，且片段大小与目的条带一致（测序结果与目的基因序列一致）. qRT-PCR溶解曲线显示：只有单一主峰，没有其它杂峰出现，说明所设计引物特异性良好.引物扩增效率均在85%～100%.所设计引物符合实验要求（表1）.

表1 候选内参基因引物Table 1 Primers used to amplify candidate reference genes

2.2 候选内参基因在样品中的平均表达水平

图1 候选内参基因平均表达水平Fig.1 Average expression levels of candidate reference genes

利用比较Ct值的方法评估各候选内参基因在所有样品综合胁迫下平均表达水平（图1）.由图1可知，综合胁迫下：18s的Ct值最小，平均表达水平最高，cyp的Ct值最大，平均表达水平最低；其它各候选内参基因平均表达水平相差不大，Ct值集中在22～28.

2.3 候选内参基因在不同样品中相对表达量

由图2可知，同一候选内参基因在不同Zn2+浓度处理下其表达水平各异，但随着Zn2+浓度的升高，Ct值总体呈现上升趋势，候选内参基因表达呈下降趋势.

图2 候选内参基因不同样品中相对表达量Fig.2 Relative expression of candidate reference genes in different samples

2.4 所有样品中候选内参基因稳定性分析

表2 所有样品中候选内参基因的表达稳定性Table 2 Expression stability of candidate reference genes in all samples

利用在线评估工具分析所有样品中候选内参基因的稳定性（表2）.由表2可知：18s和tub是最不稳定内参基因； the comparative ΔCt method，BestKeeper， NormFinder分析表明ef1是最稳定的内参基因， h2a、ubi、act是稳定性较好的内参基因. geNorm分析表明act、ubi是最稳定的内参基因， ef1、h2a是稳定性较好的内参基因.通过对上述四个软件结果的综合分析进行综合排名（稳定性由高到低）：ef1＞ubi＞act＞h2a＞gapdh＞cyp＞18s＞tub.

2.5 候选内参基因在不同Zn2+浓度胁迫下稳定性分析

在线评估不同Zn2+浓度胁迫下候选内参基因稳定性，得到候选内参基因稳定性综合排名（表3）. Zn2+＜100mg/kg时， tub为最稳定内参基因，ef1是较好内参基因； Zn2+＞200mg/kg时， ef1为最佳内参基因， 18s、tub为最不稳定内参基因.

对不同Zn2+浓度处理下内参基因稳定性分析表明：在低浓度（＜100mg/kg）处理下，tub （1.97）为最佳内参基因而中高浓度（＞200mg/kg）胁迫下，tub稳定性随Zn2+浓度的升高变化较大（表3）.据相关报道表明Tubulin蛋白与钙离子密切相关［24］，在天蓝苜蓿与根瘤菌共生结瘤过程中，伴随钙流、钙峰的形成［25-26］，随着Zn浓度的升高，结瘤数目越来越少，当Zn浓度达到400mg/kg时，结瘤数几乎为0，这与tub随Zn浓度升高越来越不稳定一致.因此当Zn浓度不足以对天蓝苜蓿共生互作造成明显影响时可以使用tub作为内参基因，但在中高浓度下研究基因表达时应避免使用tub作为内参基因.同时进一步说明筛选最佳内参基因的必要性.

表3 候选内参基因在不同锌浓度胁迫样品中稳定性Table 3 Stability of candidate reference genes in different zinc stress concentration

2.6 最适内参基因数目判定

越来越多的实验表明，使用2个或2个以上内参基因校正目的基因表达可以保证结果准确性［27］.利用geNorm软件判定本研究最适内参基因数目，对所有样品或某一Zn2+浓度处理样品分析，V2/3均小于0.15（图3）.分析表明研究天蓝苜蓿接种根Zn胁迫下基因表达分析时，选取两个内参基因足以得到准确结果.

目前，对内参基因筛选大多使用geNorm单一软件或两个软件结合［28-30］，这就不可避免带来分析误差.本研究使用在线评估内参基因稳定性工具，该工具不仅包含了ΔCt method、BestKeeper、NormFinder、geNorm分析软件而且综合4个软件分析结果给出综合排名，避免了单一软件分析带来的误差.

图3 geNorm软件评估最适内参基因数目Fig.3 Evaluation of optimal number of reference genes for normalization by geNorm

3 结语

本研究通过the comparative ΔCt method、BestKeeper、NormFinder、geNorm分析软件以及依据上述4个软件得出的结果综合分析，对8个候选内参基因进行稳定性排名.结果表明天蓝苜蓿接种根在低浓度Zn2+处理下tub是最稳定内参基因，中高浓度胁迫下ef1是最佳内参基因，最后根据不同Zn2+浓度处理选择最适的内参基因组合.这为研究重金属Zn污染土壤基因的表达研究提供参考.

［1］Nriagu J O. Global metal pollution： Poisoning the Biosphere ［J］. Environment， 1990，32（7）：7-32.

［2］朱永官，陈保冬，林爱军，等.珠江三角洲地区土壤重金属污染控制与修复研究的若干思考 ［J］. 环境科学学报， 2005，25（12）：1575-1579.

［3］Carrasco J A， Armario P， Pajuelo E， et al. Isolation and characterisation of symbiotically effective Rhizobium resistant to arsenic and heavy metals after the toxic spill at the Aznalcollarpyrite mine ［J］. Soil Biol. Biochem.， 2005，37（6）：1131-1140.

［4］Bradshaw D. Reclamations of land and ecology of ecosystem ［M］. Cambridge：Cambridge University Press， 1987：53-74.

［5］Piha M I， Vallack H W， Reeler B M， et al. A low input approach to vegetation establishment on mine and coal ash wastes in semi-arid regions.Ⅱ.Lagooned pulverized fuel ash in Zimbabwe［J］. Journal of Applied Ecology， 1995，32：382-390.

［6］Jha P K， Nair S， Gopinathan M C， et al. Suitability of rhizobiainoculated wild legumes Argyrolobium flaccidum， Astragalus graveolens， Indigofera gangetica and Lespedeza stenocarpa in providing a vegetational cover in an unreclaimed limestone quarry ［J］. Plant and Soil， 1995，177（2）：139-149.

［7］Smyth C R. Native legume transplant survivorship and subsequent seedling recruitment on unamended coal mine soils in the Canadian Rocky Mountains ［J］. Mountain Research and Development， 1997，17（2）：145-157.

［8］Chen H Y， Chou M X， Wang X Y， et al. Profiling of Differentially Expressed Genes in Roots of Robinia pseudoacacia during Nodule Development Using Suppressive Subtractive Hybridization ［J］. Plos. One， 2013，8（6）：e63930.

［9］Chen T， Zhu H， Ke D. A MAP Kinase Kinase Interacts with SymRK and Regulates Nodule Organogenesis in Lotus japonicus［J］. Plant Cell， 2012，24（2）：823-838.

［10］Scholtz J J， Visser B. Reference gene selection for qPCR gene expression analysis of rust-infected wheat ［J］. Physiological and Molecular Plant Pathology， 2013，81：22-25.

［11］Zhu J F， Zhang L F， Li W F， et al. Reference gene selection for quantitative real-time PCR normalization in Caragana intermedia under different abiotic stress conditions ［J］. Plos. One，2013，8（1）：e53196.

［12］Vega-Bartol J， Santos RR， et al. Normalizing gene expression by quantitative PCR during somatic embryogenesis in two representative conifer species： Pinus pinaster and Picea abies ［J］. Plant Cell Rep.， 2013，32（5）：715-729.

［13］Reddy DS， Bhatnagar-Mathur P， Cindhuri KS， Sharma KK. Evaluation and Validation of Reference Genes for Normalization of Quantitative Real-Time PCR Based Gene Expression Studies in Peanut ［J］. Plos. One， 2013，8（10）：e78555.

［14］Kundu A， Patel A， Pal A. Defining reference genes for qPCR normalization to study biotic and abiotic stress responses in Vigna mungo ［J］. Plant Cell Rep， 2013，32（10）：1647-1658.

［15］Park C M， Hong S Y， Seo P J， et al. Exploring valid reference genes for gene expression studies in Brachypodium distachyonby real-time PCR ［J］. Bmc. Plant Biol.， 2008，8：112.

［16］VanGuilder H D， Vrana K E， Freeman W M. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis ［J］. Bio. Techniques， 2008，44（5）：619-626.

［17］Derveaux S， Vandesompele J， Hellemans J. How to do successful gene expression analysis using Real-time PCR ［J］. Methods， 2010，50（4）：227-230.

［18］Vincent J M. The cultivation， isolation and maintenance of rhizobia ［M］. A Manual for the Practical Study of the Root-Nodule Bacteria. Blackwell Scientific， Oxford， 1970：1-13.

［19］Xie F， Xiao P， Chen D， et al. miRDeepFinder： a miRNA analysis tool for deep sequencing of plant small RNAs ［J］. Plant Mol. Biol.， 2012，80（1）：75-84.

［20］Silver N， Best S， Jiang J， Thein S L. Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR ［J］. BMC Mol. Biol.， 2006，7：33.

［21］Pfaffl M W， Tichopad A， Prgomet C， Neuvians T P. Determination of stable housekeeping genes， differentially regulated target genes and sample integrity： BestKeeper—Excel-based tool using pair-wise correlations ［J］. Biotechnol. Lett.， 2004，26：509-515.

［22］Andersen C L， Jensen J L， Orntoft T F. Normalization of realtime quantitative reverse transcription-PCR data： a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization， applied to bladder and colon cancer data sets ［J］. Cancer Res.， 2004，64：5245-5250.

［23］Vandesompele J， De Preter K， Pattyn F， et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes ［J］. Genome Biol.， 2002，3（7）： RESEARCH0034.

［24］Serrano L， Valencia A， Caballero R， et al. Localization of the high affinity calcium- binding site on tubulin molecule ［J］. Journal of Biological Chemistry， 1986，261（15）：7076-7081.

［25］Felle H H， Kondorosi E， Kondorosi A， et al. Elevation of the cytosolic free ［Ca2+］is indispensable for the transduction of the nod factor signal in alfalfa ［J］. Plant Physiol.， 1999，121（1）：273-279.

［26］Wais R J， Galera C， Oldroyd G， et al. Genetic analysis of calcium spiking responses in nodulation mutants of Medicago truncatula［J］. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2000，97（24）：13407-13412.

［27］Nailis H， Coenye T， Van Nieuwerburgh F， et al. Development and evaluation of different normalization strategies for gene expression studies in Candida albicans biofilms by real-time PCR ［J］. BMC Molecular Biology， 2006，7（1）：25-33.

［28］李 冉，李建彩，周国鑫，等.水稻虫害诱导相关基因实时定量PCR中内参基因的选择 ［J］. 植物学报， 2013，48（2）：184-191.

［29］苏晓娟，樊保国，袁丽钗，等.光定量PCR分析中毛果杨内参基因的筛选和验证 ［J］. 植物学报， 2013，48（5）：507-518.

［30］Trond Løvdal， Cathrine Lillo. Reference gene selection for quantitative real-time PCR normalization in tomato subjected to nitrogen， cold， and light stress ［J］. Analytical Biochemistry， 2009， 387：238-242.

Reference gene selection for quantitative real-time PCR normalization in Medicago Lupulina under zinc stress.

ZHANG De-hui， SUN Ya-li， ZHAO-Liang， CHOU-Min-xia*（College of Life Sciences， State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas， Northwest Agriculture and Forestry University， Yangling 712100， China）. China Environmental Science， 2015，35（3）：833～838

Expression stability of candidate reference genes （h2a、act、18s、tub、ubi、ef1、cyp、gapdh） was tested for qRT-PCR during growth conditions under the different zinc stress. The roots of Medicago lupulina inoculated with rhizobia were harvested in 30days as plant materials. Our results showed that the average expression stability of the eight candidate reference genes from high to low was ef1＞ubi＞act＞h2a＞gapdh＞cyp＞18s＞tub overall. Specifically， tub （1.97）and ef1 （2.06） were better reference genes under the low Zn2+concentration （100mg/kg）； The genes ef1 （1.41） and ubi（2.51） were the best genes under Zn2+concentration （200mg/kg）； Under Zn2+concentration （300mg/kg）， ef1 （1.41） and h2a （2.78） were the most comparatively suitable genes； while ef1 （2.45） and act （2.55） were considered as the most reliable reference genes under the high Zn2+concentration （400mg/kg）. In conclusion， All results provide the theoretical foundation for gene expression study in Medicago lupulina under the different Zn2+concentration.

Medicago Lupulina；the inoculated roots；reference gene；quantitative real-time PCR；Zn

X53

A

1000-6923（2015）03-0833-06

张德辉（1989-），男，山东武城县人，西北农林科技大学硕士研究生，主要从事微生物资源与利用的研究.

2014-06-20

国家自然科学基金资助项目（31172252）

* 责任作者， 副教授， minxia95@126.com