薛圆圆，孙宝盛*，杜 江，薛士琼，王明圆，李 恺（.天津大学环境科学与工程学院，天津 30007；.中国建筑设计研究院，北京 00044）

贫营养条件下IAMBR污泥微生物群落结构的演变

薛圆圆1，孙宝盛1*，杜 江2，薛士琼1，王明圆1，李 恺1（1.天津大学环境科学与工程学院，天津 300072；2.中国建筑设计研究院，北京 100044）

采用PCR-DGGE技术并结合系统处理效果研究了贫营养条件下IAMBR污泥微生物群落结构，结果表明：IAMBR污泥中总细菌多样性特征、相似性特征和种群归属特征具有高度的协同性.运行前18天，氨氮去除率由95%降至73%后增加至82%，同时SVI值由123.7mL/g升至135.2mL/g再降至128.4mL/g.微生物群落在试验末期演替剧烈，总细菌相似性指数下降到63.6%，SVI值最终升至132.5mL/g.通过克隆测序分析，IAMBR系统中微生物菌种大部分为未培养菌种，其中亚硝化螺菌属占据优势地位，说明贫营养环境对IAMBR微生物群落产生不良影响，污泥微生物功能性指向明显，即硝化功能菌占据优势地位.

贫营养；IAMBR；PCR-DGGE；活性污泥；微生物群落结构

膜生物反应器（MBR）研究距今已有40多年，具有高污泥浓度，泥龄长，对氨氮的去除效果好，占地面积少等［1］特点被广泛应用于生活污水、工业废水、医疗废水、垃圾渗滤液处理等领域［2-3］.而间歇曝气式膜生物反应器（IAMBR）对总氮的去除效果和活性污泥抗冲击能力都优于MBR而被研究［4］.IAMBR在长污泥龄下运行，随着微生物浓度升高有机负荷下降，微生物易于处在营养相对贫乏的状态，进而加剧膜污染.微生物群落结构的变化能灵敏的反映出环境现状及变化趋势，在污水治理中具有重要的指导作用［5］，但针对贫营养下IAMBR中微生物群落结构变化及对膜污染影响的研究了解还较少.

PCR-DGGE技术可从样品微生物中提取DNA或RNA，将宏观现象与微观分子相结合，它能鉴别出不可培养的细菌，并对细菌生态学的发展起到了巨大的推动作用［6］，成为对微生物种群演替进行分析的主要分子生物学方法之一［7］.

本研究以无碳源进水为限制条件对污泥进行周期培养，采用PCR-DGGE技术考察完整运行周期内反应器污泥中微生物群落结构演替和优势菌群的变化，以期对延缓膜污染，优化IAMBR运行提供理论指导.

1 材料与方法

1.1 试验装置和运行条件

试验采用IAMBR工艺，接种污泥取自某高校MBR反应池，工艺流程见图1所示，池体采用有机玻璃结构，有效容积4L，反应器高50cm，内截面积10cm×10cm.中间设一隔板，隔板长20cm，下端距底5cm，起到平衡曝气和模拟水力循环的作用.体积大的区域放置浸没式无纺布平板膜一片，底设砂头曝气装置2个，体积较小的区域放置搅拌器.曝气：停曝=2h：1h，按此方式循环运行.曝气时搅拌停止，停曝时搅拌开启.格内水位降到3.5L时电磁阀开启，由高位水箱进水至4L同时电磁阀关闭停止进水.水力停留时间8.5h，进水pH值7.5～8，DO初期2～3mg/L，后期为增强对膜表面的冲刷、减少膜污染，DO维持在3～4mg/L.采用间歇进水连续出水方式.

图1 试验工艺流程示意Fig.1 Schematic diagram of the IAMBR process

1.2 试验原水与取样方法

以碳源作为限制营养，人工配置进水，组成见表1.取一定体积的MBR活性污泥混合液，静沉2h后去上清液，蒸馏水清洗，重复此步骤3次以去除原水基质.

表1 进水组分及浓度（mg/L）Table 1 Components and concentration of influent （mg/L）

试验开始前投加上述预处理污泥和原MBR反应池废水至IAMBR反应器内，以实际废水进水驯化一周，最终形成污泥浓度5500mg/L左右的混合液.

正式开始试验后，试验不间断运行24d，期间不排泥［8］.并在第1，2，4，8，12，16，20，24d取样，提取活性污泥样品DNA，编码I1～I8.每次取样均从污泥混合液中获取，取样20mL，活性污泥样品预先在-20℃保存，提取前离心破壁预处理.

1.3 样品预处理

取50mL灭菌离心管，加入15mL污泥混合液，6～10℃、9165×g下离心10min；去上清液，并加入灭菌去离子水30mL；相同条件下离心10min；去上清液，加入灭菌1×TE缓冲液30mL，漩涡振荡混匀；去上清液，加入灭菌去离子水15mL混匀.

1.4 样品DNA的提取

采用化学裂解-酚/氯仿/异戊醇抽提-试剂盒纯化法提取样品DNA，具体方法参见文献［9］.

1.5 总细菌的PCR扩增

采用适合大多数细菌和古细菌16SrDNA基因V3区的通用引物对F357-GC和R518，扩增产物片段长约240bp［10］.PCR扩增采用50μL反应体系，组成为：1μLDNA模板，25μL2×Taq PCR Master Mix，1μL的25μmol/L 上游引物，1μL的25μmol/L 下游引物，其余用无菌超纯水补足至50μL.

采用降落式PCR 反应策略：94℃下预变性5min，前20个循环是94℃变性1min，65～55℃退火1min，72℃延伸1min（每个循环后退火温度下降0.5℃），后10 个循环是94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，最后在72℃下延伸8min［11］.

1.6 总细菌PCR产物的DGGE分析

采用C.B.S.SCIENTIFIC公司DGGE-2001系统对总细菌PCR产物进行变性梯度凝胶电泳分离［12］，完成后将凝胶进行硝酸银染色，碳酸钠显影，最后将胶板于观测仪中拍照存档.

1.7 凝胶片段的回收和克隆测序

切取凝胶上清晰明亮的独立条带，浸泡在50μL灭菌去离子水中，80℃水浴加热20min，然后进行总细菌的PCR扩增，扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中检测，当DGGE鉴定为单一条带后，将扩增产物送至上海生工生物科技有限公司完成克隆测序.

1.8 样品的生物多样性分析与相似性分析

应用Quantity One软件对得到的DGGE图谱进行定性分析.利用Shannon-Wiener （H）多样性指数评价微生物种群多样性.应用戴斯系数（Cs）判定微生物种群相似性.

Shannon-Wiener指数公式：

式中：Pi=ni/N ；ni是菌种i的峰面积；N是所有峰的总面积.

戴斯系数公式：

式中： j是泳道A和B的共有条代数；a和b是泳道A和B的各自条代数.

2 结果与讨论

2.1 贫营养条件对氨氮、总氮去除的影响

图2、图3给出了试验运行期间IAMBR内氨氮、总氮的去除情况.图2显示，整个工况期间，进水水质波动不大，而出水氨氮呈现出先增后减再增加态势.说明IAMBR中期出水氨氮降低不是由进水水质不稳定所致，而是反应器去除能力增强所造成的.

图2 IAMBR的氨氮去除效果Fig.2 Removal effect of ammonia nitrogen in the IAMBR

从曲线可看出，前7d内氨氮去除率由95%降至73%，之后的7～18d内又升至82%，末期才再次回落，降到周期内最低点69%.这与污泥容积指数监测结果吻合，SVI值在7～18d内发生下降即污泥沉降性能增强.推测这是由于硝化细菌的数量短暂增加所致.贫营养条件刺激微生物代谢EPS、SMP并被膜截留而积累，尽管EPS、SMP可被生物降解，但被微生物利用呈现滞后性，当条件继续恶劣时，微生物对二者的吸附能力降低，EPS、SMP浓度增加，反而抑制硝化反应，致使试验最后氨氮去除率降到最低.

图3显示，整个工况期间，除前3d总氮仍有一定的去除效果外，基本维持进水含量水平，最后6d出水总氮高于进水总氮.间歇曝气有利于实现反硝化作用，达到同步硝化反硝化的目的.试验前4d EPS溶解产生的SMP可被微生物利用［13］，污泥活性得到维持，所以贫营养运行后总氮仍有一定的去除率.

图3 IAMBR的总氮去除效果Fig.3 Removal effect of total nitrogen in the IAMBR

图4 出水硝态氮含量的变化Fig.4 Changes of nitrate and nitrite in the effluent

图4示IAMBR出水中硝态氮含量的变化，从曲线可看出，反应器内没有的积累.趋于稳定后出水的平均值为21.40mg/L.贫营养条件限制进水碳源的补充，因此反硝化受阻.所以图4中前3d浓度迅速增加，由3.14mg/L变为21.40mg/L.说明系统硝化反应进行良好，反硝化不彻底，氮的转化一直停留在硝酸盐阶段.

2.2 污泥培养期内MLSS、SVI及SV的变化情况

IAMBR运行期内，每2～4d在好氧段末取100mL均匀污泥混合液静置30min，观察污泥所占比例.图5显示IAMBR内污泥浓度和污泥体积指数的变化情况.贫营养条件会加剧内源呼吸和EPS释放，不利于污泥沉降，所以前7d SVI的上升与EPS的释放有关. EPS能被丝状菌优先利用，进而引起污泥膨胀［8］.贫营养条件下，SMP对污泥的活性有抑制作用.因此试验初期，MLSS从5660mg/L降到5030mg/L，7～11d出现小幅增幅到5210mg/L，之后呈下降趋势.

图5 IAMBR污泥浓度和体积指数的变化Fig.5 Changes of MLSS， SVI in the IAMBR

污泥沉降比随时间变化如图6.接种污泥SV是75%，试验期内SV呈波动下降，规律性不明显.总体保持在60%～70%之间，试验后期相比于前期，SV值更低一些.

图6 IAMBR污泥沉降比的变化Fig.6 Changes of SV in the IAMBR

2.3 总细菌的DGGE图谱分析

在贫营养IAMBR系统内选取的8个不同时期污泥样品，经提取总细菌基因组PCR扩增后，进行DGGE图谱分析，结果如图7所示.从图7可以看出，贫营养条件下，IAMBR微生物种群结构经历了一个明显的变化过程.根据条带的变化，细菌种类大致可分作五类，见表2.

图7 污泥样品总细菌DGGE分离图谱Fig.7 DGGE profile of bacteria in sludge samples

从图7看出，共4条条带在整个贫营养周期内始终存在，如条带2、3、7、10.贫营养对这些菌种的影响较小，从而保证了碳源匮乏下污水处理的效果.其中条带2、7是不同阶段的优势菌种.结合表3可知，贫营养条件下IAMBR系统中优势菌种大部分为未培养菌种（Uncultured bacterium），表明自然环境尤其极端环境下存在大量不可培养的微生物，被鉴定出的微生物仅仅是极小的一部分［14］.变形菌门下的Nitrosospira占据了测序条带不少的比例，条带2、9、11均属于此类型功能菌群.其中条带2与亚硝化螺菌属（Nitrosospira）同源性只有91%，亚硝化螺菌属大多为专性化能自养型好氧菌，不能利用有机培养基［15］，因此推测能较好的适应贫营养环境，这也解释了系统中良好硝化作用的现象.条带9末期消失，说明该菌未能适应末期极端条件而被淘汰.运行16d后，条带11出现，亮度偏弱，丰度较低，表明该菌能适应劣势碳源匮乏条件但并不占据优势地位.条带3代表假单胞菌属（Pseudomonas），具备世代周期长、好氧、分解复杂有机物和脱氮除磷的特点，属脱氮功能的菌群［16］.条带3始终存在反应体系，能有力的抵抗贫营养环境，属优势菌种，这同样解释了系统中良好硝化作用的现象.样品I1还包括条带5、8，运行2d后消失，推测这些菌群对极端条件敏感，无法适应而处于休眠状态或被淘汰.

表2 污泥样品总细菌图谱的条带分类Table 2 Classification of bacterial bands in the DGGE profile

图7中条带8代表γ-变形菌（Gamma proteobacterium）.该类菌种属厌氧或兼性厌氧菌，已被发现于多种不同的污水生物处理中，通过细菌胞外酶作用，大分子有机物被降解成水溶性的小分子［17］，对有机物的去除起主要作用.运行12d后条带8又出现，亮度虽弱但开始稳定存在于系统中，推测γ-变形菌休眠后经过数量上的选择逐渐适应新环境而存在于末期IAMBR系统中.条带6代表酸杆菌属（Acidobacteria），异养型嗜酸菌，所以在碳源匮乏的条件下仅仅存在于个别泳道，但目前对它们的研究较少，在土壤生态系统中占据重要地位［18］.变形菌门下红环菌属（Dechloromonas），为革兰氏阴性菌，光合类，可利用不同的有机底物进行厌氧光照生长或黑暗好氧生长，常见于序批式反应器活性污泥中［19］.条带10属该类菌属，降解能力可变，适应贫营养环境，因此属于IAMBR中的优势菌.

表3 部分条带16S rDNA对比结果Table3 Comparisons of some partial 16S rDNA sequences

2.4 总细菌的Shannon-Wiener多样性指数分析

从图8可知，IAMBR初始污泥菌群多样性最高，因为正常环境下微生物群落结构最为完整.随着贫营养的进行，多样性指数下降，说明部分微生物对极端环境敏感，生长受到抑制.运行第8d多样性指数显著回升，推测出现适应碳源匮乏条件的自养微生物，从而多样性指数短暂回升.此后直至贫营养末期，多样性指数基本稳定，说明贫营养条件基本完成对微生物的选择.由于膜高效截留特点，即便碳源持续匮乏导致多样性指数下降，H指数扔维持在0.8上下.

图8 样品DGGE条带的Shannon指数Fig.8 Shannon index of DGGE in samples

2.5 总细菌DGGE图谱的相似性分析和聚类分析

总细菌种群相似性分析见图9.图9是以正常运行条件下的I1作为对照时各泳道与其相似性的比较图.与DGGE凝胶电泳图谱类似，I2、I3与I1的泳道相似性更为接近，平均值86%，说明菌群大部分处于缓冲适应期，群落结构变化较小.I4～I7这段时期内与I1的相似性差别较大，且呈不规则变化趋势，一方面由于菌群适应极端环境作出正面调节，另一方面因为碳源匮乏内源呼吸加剧又对菌群产生负面调节.总体上与该段H指数变化趋势较为一致.末期I8泳道相似性指数最低，为63.6%，说明微生物调整已接近极限，与初期I1相似性差距最大.

图9 样品总细菌各泳道相似性图谱Fig.9 Similarity index of the bacteria in samples

图10 总细菌DGGE 图谱的聚类分析Fig.10 Cluster analysis of bacterial DGGE

采用UPGMA算法对污泥样品泳道进行族群划分，结果如图10所示.IAMBR样品可大致分为三大族群：I1～I4为一族群，I5～I7为一族群，I8单独为一个族群.前两个族群相似性75%，与I8族群相似性仅为66%.取样的时间顺序与划分结果相对应，说明间歇曝气一定程度上可延缓微生物群落变化，即在贫营养末期菌群结构才会发生明显变化.

3 结论

3.1 贫营养条件下，IAMBR污泥微生物群落结构演替明显，其中既有始终存在的优势菌种，又有不适应该环境而渐渐消失的菌种，还有部分适应此极端环境而出现的菌种.IAMBR污泥中微生物会随生存条件的改变来调整自身结构，以适应极端环境提高污水处理效果.

3.2 随着贫营养条件的进行，污泥中总细菌多样性指数逐渐降低并趋于稳定，相似性指数在经历缓冲时期和不规则变化后，在I8时期相差最大，形成三大族群.相邻泳道相似性指数变化不大，说明总细菌为适应环境而逐步有序的进行调整.

3.3 切胶测序发现，贫营养条件下IAMBR总细菌中大部分属于未经培养菌种，已经检测出的Nitrosospira始终存在系统内并占据优势地位，另外还存在Pseudomonas和Gamma proteobacterium等类别，为优化IAMBR处理洗浴水的长期运行和减缓膜污染提供定的理论依据.

［1］Fenu A， Roels J， Wambecq T， et al. Energy audit of a full scale MBR system ［J］. Desalination， 2010，262（1/3）：121-128.

［2］梁文钟，汤 兵，陈 烜，等.浸没式膜生物反应器中生物质的增殖及其对运行效能的影响 ［J］. 中国环境科学， 2013，33（8）：1399-1406.

［3］Roberts J A， Sutton P M， Mishra P N. Application of the membrane biological reactor system for combined sanitary and industrial wastewater treatment ［J］. International Biodeterioration and Biodegradation， 2000，46（1）：37-42.

［4］Benaliouche H， Abdessmed D， Nezzal G. The effects of operation conditions of carbon/nitrogen ratio and PH on nitrogen removal in intermittently aerated membrane bioreactor ［J］. Desalination and Water Treatment， 2013，51（4-6）：1057-1062.

［5］孙庆华，柏耀辉，赵 翠，等.DGGE、T-RFLP、LH-PCR对两种活性污泥的微生物种群多样性分析的比较 ［J］. 环境工程学报，2009，3（8）：1365-1355.

［6］Namba A， Shigenobu Y， Kobayashi M， et al. A new primer for 16S rDNA analysis of microbial communities associated with Porphyra yezoensis ［J］. Fisheries Science， 2010，6（5）：873-878.

［7］Sanz J L， Kochling T. Molecular biology techniques used in wastewater treatment： An overview ［J］. Process Biochemistry，2007，42（2）：119-133.

［8］黄 兴，孙宝盛，孙井梅，等.贫营养条件下EPS、SMP和微生物多样性的研究 ［J］. 环境科学， 2009，30（5）：1468-1472.

［9］Rosenbrger S， Laabs C， Lesjean B， et al. Impact of colloidal and soluble organic material on membrane performance in membrane bioreactors for wastewater treatment ［J］. Water Research， 2006，40（4）：710-720.

［10］Muyzer G， Waal E C， Uitterlinden A G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified genes encoding for 16S rRNA ［J］. Applied and Environmental Microbiology，1993，59（3）：695-700.

［11］Miura Y， Hiraiwa M N， hoe T， et a1. Bacterial community structures in MBRs treating municipal wastewater： Relationship between community stability and reactor performance ［J］. Water Research， 2007，41（3）：627-637.

［12］陈 谊，孙宝盛，张 斌，等.不同MBR反应器中硝化菌群落结构的研究 ［J］. 中国环境科学， 2011，30（1）：69-75.

［13］齐庚申，陈 谊，孙宝盛，等.膜生物反应器中贫营养条件下SMP的产出研究 ［J］. 环境科学与技术， 2010，33（2）：52-55.

［14］Amann R I， Ludwing， Schleifer K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation ［J］. Microbiological Reviews， 1995，59（1）：143-169.

［15］Liz J. Shaw， Graeme W. Nicol， Zena Smith， et al. Nitrosospira spp. Can produce nitrous oxide via a nitrifier denitrification pathway［J］. Environmental Microbiology， 2006，8（2）：214-222.

［16］郭飞宏，郑 正，张继彪.PCR-DGGE技术分析塔式蚯蚓生态滤池微生物群落结构 ［J］. 中国环境科学， 2011，31（4）：597-602.

［17］Kapley A， Purohit H. Changes in microbial diversity in fed-batch reactor operation with wastewater containing nitroaromatic residues ［J］. Bioresource Technology， 2007，98（13）：2479-2484.

［18］张政科，虢清伟，颜智勇，等.PCR-DGGE研究沸石植生混凝土微生物群落结构 ［J］. 中国环境科学， 2013，33（9）：1615-1621.

［19］Ramesh K. Goel， Patricia Sanhueza， Daniel R. Noguera. Evidence of Dechloromonas sp. Participating in enhanced biological phosphorus removal （EBPR） in a bench-scale aerated-anoxic reactor ［J］. Proceedings of the Water Environment Federation，2005，41（8）：3864-3871.

Analysis of IAMBR on succession of sludge microbial community composition in the oligotrophic condition.

XUE Yuan-yuan1， SUN Bao-sheng1*， DU Jiang2， XUE Shi-qiong1， WANG Ming-yuan1， LI Kai1（1.School of Environmental Science and Engineering， Tianjin University， Tianjin 300072， China；2.China Architecture Design and Research Group，Beijing 100044， China）. China Environmental Science， 2015，35（3）：839～845

The microbial community in the IAMBR activated sludge grown in a oligotrophic condition was investigated with PCR-DGGE technology and the treatment effect of the IAMBR system was evaluated. The results showed that there was a high degree of cooperativity among the diversity， similarity and population belonging of the total bacteria. In the first 18days， the ammonia nitrogen removal dropped from 95% to 73%， and then increased to 82%. At the same time， the SVI increased from 123.7mL/g to 135.2mL/g， and then decreased to 128.4mL/g. Microbial community experienced a drastic succession at the end of experimental period. The similarity index of bacteria dropped to 63.6%， and the SVI increased to 132.5mL/g eventually. The cloning sequencing analysis revealed that the majority of bacteria in the IAMBR belonged to uncultured bacterium and the Nitrosospira held a dominant position. The research showed that oligotrophic condition had adverse effects on microbial community in the IAMBR. The sense of functional orientation of the microbial community was obvious and the nitrifying bacteria occupied a dominant position.

oligotrophic；IAMBR；PCR-DGGE；activated sludge；microbial community composition

X172

A

1000-6923（2015）03-0839-07

薛圆圆（1991-），女，山东日照人，天津大学硕士研究生，主要从事水污染控制与环境微生物学研究.

2014-07-18

天津市应用基础研究计划项目（07JCZDJC02100）

* 责任作者， 副教授， Baosheng_sun@sina.com