马佳林，聂小琴*，董发勤，代群威，张 东，杨 杰，周 娴，黄 荣，龚俊源，龚运军（.西南科

技大学，核废物与环境安全国防重点学科实验室，四川 绵阳 621010；2.中国工程物理研究院核物理与化学研究所，四川 绵阳 621900）

三种微生物对铀的吸附行为研究

马佳林1，聂小琴1*，董发勤1，代群威1，张 东2，杨 杰1，周 娴1，黄 荣1，龚俊源1，龚运军1（1.西南科

技大学，核废物与环境安全国防重点学科实验室，四川 绵阳 621010；2.中国工程物理研究院核物理与化学研究所，四川 绵阳 621900）

开展了酵母菌（真菌）、枯草芽孢杆菌（细菌）、小球藻（藻类）对水体中铀（Ⅵ）的吸附性能及机理研究.结果表明：3种微生物对铀都具有较好的吸附效果.酵母菌，小球藻，枯草芽孢杆菌对铀的最佳吸附率分别为97.19%、97.13%、98.03%；且最大吸附量分别达到341.2、356.5、512.5mgU/g（DW）.3种微生物对铀的吸附过程和机理有所不同，酵母菌和小球藻符合Langmuir模型，枯草芽孢杆菌更适合Freundlich模型，吸附至12h，酵母菌表面逐渐出现铀和磷的片状结晶及含铀沉积物堆积，小球藻和枯草芽孢杆菌与铀（50mgU/L）作用后细胞出现明显变形，菌体表面未出现铀的结晶物.

铀；微生物；吸附；机理

随着核工业的不断发展以及核设施的退役，由此产生的含铀放射性废水种类和数量越来越多，通过地表径流和地下迁移、渗透而进入土壤和水体的铀污染问题对人类健康和自然环境造成潜在的威胁［1-3］.近20 年来，国内外学者针对铀污染环境的原位生物修复开展了大量的研究工作［4-9］.有研究表明在放射性废物库附近的土壤和地下水中，通过微生物菌毛原位传递电子获取提供生存能量并促进可溶性U（Ⅵ）原位还原成溶解性小的U（Ⅳ），或者通过还原酶的分泌及胞外代谢产物进行铀的沉淀和矿化等作用可以有效的阻滞或延缓铀的迁移［6-9］.关于微生物原位修复铀污染环境，研究对象主要包括细菌、真菌、藻类等三大类［1-2，12］，不同种类微生物对铀存在着不同的吸附性能和作用机制，主要表现为离子交换，络合沉淀，胞内赋存，生物矿化，氧化还原等等［10-16］.微生物与铀的相互作用受介质成分、环境条件、细胞结构和代谢过程等多种因素的影响，表现出的作用方式也不尽相同.

因此，本研究选取酵母菌、小球藻、枯草芽孢杆菌为几类微生物的典型代表为研究对象，在相同条件下，比较分析不同种类微生物对铀的吸附性能及机理，旨在为生物修复铀污染环境的研究提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株及试剂 酵母菌为市售安琪面包酵母；小球藻和枯草芽孢杆菌由西南科技大学生命科学与工程学院实验中心提供.

铀溶液的配置：准确称取2.1092g的硝酸铀酰［UO2（NO3）2·6H2O］，少量水溶解后，加入10mL硝酸，移入1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即为铀浓度为1g/L的铀溶液.通过去离子水稀释得到其他浓度的铀溶液，采用0.1mol/L HNO3、10g/L Na2CO3和5g/L NaHCO3的缓冲液调节溶液pH值.

1.1.2 主要试验仪器 紫外可见分光光度计（UV-1600，上海美谱达仪器有限公司）；离心机（LD5-2B，北京雷勃尔离心机有限公司）；场发射扫描电子显微镜（Ultra55，德国蔡司仪器公司）；能谱仪（Oxford IE450，英国Oxford公司）.

1.3 实验方法

1.3.1 菌体制备 将活化后的菌体种子液接入到液体培养基中，于35℃，150r/min恒温振荡培养箱中振荡培养48h.培养后以4000r/min离心10min.取沉淀的菌体，用0.9%的生理盐水稀释为所需菌悬液（吸光度值OD600=0.5）.

1.3.2 吸附实验 准确移取20mL一定浓度的铀溶液于50mL锥形瓶中，取20mL预培养好的菌悬液离心（4000r/min）10min，将离心后的湿菌体（干重2.5～5.0mg）分别加入上述50mL锥形瓶中，置于空气恒温摇床内进行恒温振荡吸附0.5～72h，离心后取5mL上清液，测溶液中残余铀浓度，每组设置3个平行样，以铀溶液作为对照.

1.4 分析测试

1.4.1 铀的分析 水样中铀含量的检测按照偶氮胂Ⅲ分光光度法［2］进行.

1.4.2 SEM-EDS分析 供试微生物与50mgU/L铀溶液作用一定时间（0～72h）后，离心，经去离子水清洗、离心、制备成菌悬液，在盖玻片上点样，自然干燥，加入2.5%戊二醛固定10h，去掉戊二醛溶液，依次用30%、50%、70%、90%、100%乙醇溶液逐级脱水（每次脱水20min），最后自然晾干，备用.样品经过喷金处理后进行样品形貌观察和微区元素分布分析.

1.5 数据处理

式中：R为吸附率，%；C0为初始铀浓度， mgU/L；Ct为t时刻的铀浓度， mgU/L；q为吸附量， mgU/g（DW）；V为溶液初始体积，L；m为微生物的干重，g.

2 结果与分析

2.1 溶液初始pH值对微生物吸附铀的影响

溶液pH值通过改变微生物表面电位电荷分布、结合位点以及溶液中铀酰离子的络合形态，从而影响微生物对溶液中铀的吸附行为［1］.在强酸性溶液中，铀主要以形式存在，当pH＞4时逐渐水解，溶液中出现一定量的UO2OH+络合阳离子.当pH值接近6时，溶液中则主要以等络阴离子形式存在［1］.

由图1可以看出，当pH值在1.0～6.0时，随着溶液pH值不断升高，酵母菌和小球藻对铀的吸附量逐渐增加，在pH=6.0时吸附量分别240.7mgU/g（DW）、206.9mgU/g（DW）；枯草芽孢杆菌在pH=5.0时吸附量为107.6mgU/g（DW）.结合后面的扫描电镜结果可以推断，在初始浓度为100mgU/L 的条件下，枯草芽孢杆菌细胞受到严重损伤，在作用24h时细胞处于死亡状态，因此枯草芽孢杆菌与铀的作用过程可以看作是生物吸附剂对铀的吸附.生物吸附剂对溶液中离子吸附的最佳pH值通常是由吸附剂表面的等电点（pK=3～5）决定［1］，当溶液pH值超过等电点的pH值时，铀酰络阴离子与吸附剂表面的负电荷产生静电斥力，在本研究中表现为枯草芽孢杆菌在pH=6时吸附能力下降（图1）.有研究表明，酵母菌［4］和小球藻［1］细胞在大于100mgU/L的条件下仍能很好地存活.推断该类吸附行为是以依赖代谢的生物吸附为主的过程，在越适宜生存的pH值条件下，对溶液中的铀酰离子吸附作用越有利.本研究结合微生物的生长条件及含铀废水的实际情况，主要考察微生物在弱酸性环境下的最佳吸附条件，故未设置pH＞6的条件开展实验.本文选择pH=5开展后续实验.

图1 溶液pH值对3种微生物吸附铀的影响Fig.1 Effect of pH on on biosorption uranium by three kinds of microbes

2.2 初始铀浓度对微生物吸附铀的影响

由图2可以看出，在初始铀浓度为10mgU/L时，3种微生物对铀均有较好地吸附效果，吸附率在60%～80%之间.与高浓度铀溶液相比，相同接菌量的微生物在低浓度的铀溶液中，吸附位点相对充足能与微生物细胞表面充分接触，吸附率较高，当C0=50mgU/L时，酵母菌表现最佳吸附能力，吸附率达93.0%，小球藻、枯草芽孢杆菌均在10mgU/L时取得最大吸附率，分别为：77.8%、66.1%.随着溶液中初始铀浓度的增加，3种微生物对铀的吸附率整体下降，吸附量逐渐增高，当C0≥200mgU/L 后，酵母菌、小球藻吸附量趋于平衡，有研究表明［4-5］细胞壁上的吸附位点是有限的，当吸附达到平衡时，吸附位点达到饱和，此时铀的初始浓度再提高，吸附量基本接近稳定；3种微生物均在本实验中设置的最高铀浓度时获得最大吸附量，酵母菌最高，达325.5mgU/ g（DW），小球藻和枯草芽孢杆菌分别为294.9和215.0mgU/g（DW）.从对铀的吸附率和吸附量来看，总体表现为：酵母菌＞小球藻＞枯草芽孢杆菌.

图2 初始铀浓度对3种微生物吸附铀的影响Fig.2 Effect of initial uranium concentration on biosorption uranium by three kinds of microbes

2.3 接触时间对微生物吸附铀的影响

由图3可知，吸附的初始阶段（5min～12h）吸附速率很快，吸附位点充足，在1h时，酵母菌、小球藻和枯草芽孢杆菌对铀的吸附率分别为50.4%、51.7%和79.5%.随着吸附的进行，吸附速率减缓，有效吸附位点逐渐减少；24h之后，枯草芽孢杆菌对铀的吸附达到稳定，而酵母菌和小球藻经历过一段平衡时期（12～48h）之后，吸附率进一步升高.在72h时，酵母菌、小球藻和枯草芽孢杆菌对铀的吸附率分别为：75.3%、74.6%和94.7%.关于微生物对铀的吸附过程［5-10］，可以归纳为：初始阶段起主导作用的快速、可逆且无需能量的被动吸附，将铀酰离子吸附到微生物表面；第二阶段起主导作用的主动吸附，将细胞表面吸附的铀酰离子沉淀矿化或者转移至细胞内部，缓慢、不可逆，此阶段需要能量并且与细胞的代谢有关.死体微生物对铀的吸附通常仅表现为第一阶段，而活体微生物对铀的吸附还有第二阶段的进行.

图3 接触时间对3种微生物吸附铀的影响Fig.3 Effect of time on biosorption uranium by three kinds of microbes

本研究表明，枯草芽孢杆菌对铀的吸附过程以被动吸附为主，同时又异于一般死体微生物，因为在铀溶液的胁迫下，枯草芽孢杆菌体内过氧化程度加重，壁膜破坏，将分泌和释放大量的代谢或者胞外产物，这些产物与菌体表面的活性位点一并与溶液中的铀酰离子发生络合、离子交换或者沉淀矿化等作用，部分铀酰离子也可能直接快速地穿透细胞壁膜进入到体内.而酵母菌和小球藻则表现为活体微生物对铀的吸附过程，通过菌毛［6］和表面活性官能团［7-8］将溶液中的铀酰离子优先聚集在细胞表面，随着吸附的进行，可能在细胞表面发生电子转移引起氧化还原反应，将部分U（Ⅵ）还原为U（Ⅳ）［10-11］，离子交换［12］，络合沉淀［13］，结晶矿化［14-15］，胞内沉积［16］等生物物理化学多种作用.

2.4 接菌量对微生物吸附铀的影响

由图4可知，随着接菌量的增加，3种微生物对铀的吸附率也逐渐上升，当接菌量达0.4g/L时，吸附率均达90%以上.在最小接种量时，枯草芽孢杆菌表现出最大的吸附率，吸附量超过500mgU/g（DW）.随着接菌量继续增大，吸附率有较小幅度的上升，吸附量逐渐降低.分析其原因可能是随着吸附的进行，溶液中铀浓度不断下降，溶液中游离的铀酰离子减少，铀结合到吸附微生物表面的几率减小，大量的微生物在溶液中共存造成一定的空间位阻效应.在本实验中，酵母菌、小球藻、枯草芽孢杆菌的最大吸附率分别为：97.19%、97.13%、98.03%.

图4 接菌量对吸附铀的影响Fig.4 Effect of weight on biosorption uranium by three kinds of microbes

2.5 吸附等温模线

表1 等温吸附的相关参数Table 1 The related parameters of adsorption isotherm

Langmuir 吸附等温线假设吸附剂对金属离子的吸附为均一的单分子层吸附，且被吸附的离子间无相互作用.Freundlich 吸附等温线假设吸附剂对金属离子的吸附为非均一的多分子层吸附，被吸附的离子的量随着溶液浓度的增加而增大.本文采用Langmuir和Freundlich两种吸附等温模型来对3种微生物在不同U（Ⅵ）浓度下的等温吸附过程进行拟合，相关参数见表1.

由拟合结果可知，Langmuir模型能较好地描述酵母菌和小球藻对铀的吸附过程，R2分别为0.988和0.991，拟合所得的酵母菌和小球藻最大吸附量分别为344.8mgU/g（DW）和355.9mgU/g（DW），与实验所得的最大吸附量（341.2mgU/g（DW）和356.5mgU/g（DW））吻合较好，表明酵母菌和小球藻对铀的吸附过程表现为单层吸附.枯草芽孢杆菌对铀的吸附过程更适合Freundlich模型，R2=0.961，该吸附过程并不完全是单层分子的表面吸附，1/n=0.23小于0.5，吸附容易自发进行.

2.6 SEM-EDS结果与分析

图5 酵母菌与铀作用不同时间后的扫描电镜Fig.5 SEM images of yeast at different times in the adsorption process

酵母菌与50mgU/L作用不同时间（0.5～72h）后的扫描电镜结果如图5所示.未进行吸附的菌体（图5a）多数表面光滑、形态完好；0.5h后（图5b），形态基本完好，表面未见异常. 12h后（图5c）菌体有轻微塌陷，在菌体表面出现明显的片状沉积物堆积，JIANG等［14-15］研究表明，微生物在对核素进行短期吸附后，细胞壁上金属离子的结合位点可能会成为晶体的成核点.24h后，菌体出现一定的塌陷和扭曲形变，在菌体表面能观察到明显的铀结晶体出芽（图5d），该形貌与Toshihiko等［13］报道的关于铀磷无机纳米矿化体在酵母菌表面沉积图片有高度的相似性，EDS分析结果可以很好地支撑这一推断.

同时在菌体附近同样出现团状结晶（图5e），分析团状沉积物堆簇出现的原因，可能是由于在制样过程中，先经过去离子水反复清洗并离心，作用力强度过大，导致部分在菌体表面的沉淀物与菌体表面分离，并在离心力下粘附在菌体表面或脱离菌体束缚的聚集成一团；因为铀对酵母细胞的胁迫作用，导致壁膜受损，引起磷脂分解或ATP水解导致无机磷释放到溶液中，从而引起溶液中的铀酰离子与无机磷结合沉淀.

酵母菌吸附铀前后能谱分析结果如图6所示.吸附后菌体表面出现了U的吸收峰，结合能为2.0～4.0KeV；Na，Mg，Ca元素的含量明显下降，但P元素的含量明显增加.由此表明，酵母菌对溶液中铀酰离子吸附过程中，细胞中的P参与了与铀酰离子的相互作用， JIANG等［15］认为细胞表面含磷部位在铀沉淀过程中起重要作用，既是络合官能团的载体，又作为底物来诱导磷酸盐的结晶.由此推断，酵母菌表面的结晶物主要来源于菌体本身释放的磷在细胞表面上与铀的成矿作用；吸附前细胞元素含量表中有较多的Si元素，而吸附后几近没有，可能是待测样品在盖玻片上，吸附前的样品较为稀薄、分散，X-射线穿过细胞缝隙打到玻璃片上，而出现的Si吸收峰.

研究结果表明，随着吸附的进行，酵母菌表面逐渐开始出现铀-磷片状结晶、菌体附近有含铀的团状沉积物堆积，菌体之间发生粘连，菌体表面出现凹陷、皱缩，接触时间越长，细胞受到的破坏越严重.

枯草芽孢杆菌的SEM结果如图7所示，未进行吸附的菌体表面光滑、形态完好（图7a）；在吸附30min后，菌体的形态发生很大变化，呈短节状，随着吸附的进行，在24h时，菌体形态的破坏程度加重，未见修复的迹象，推测菌体基本死亡，在一些菌体表面可以见到一些片状沉积物堆积.能谱分析与细胞成分接近，C、O含量占70%以上，不含铀，疑为菌体分泌物（结果未在本文中给出）.在72h时，只观察到残缺断裂的菌体，未见酵母菌吸附后出现的铀片状结晶或沉积物.

图6 酵母菌吸附前后能谱图Fig.6 EDS results of before and after interaction of yeast and uranium.

小球藻的扫描电镜（图7e）和能谱分析结果表现为在吸附后期细胞出现明显塌陷，表面出现褶皱，并且出现粘连，整体形貌也发生了严重变化，未观察到铀的结晶物出现.菌体形态的变化可能由于铀进入细胞内部结构，对菌体的毒害作用增强，使细胞质生物大分子遭破坏，细胞内产生空壳结构，而导致脱水时细胞壁内陷.

图8 枯草芽孢杆菌、小球藻与铀作用不同时间后的SEM图Fig.8 SEM images of bacillus subtilis and chlorella at different times in the adsorption process

研究结果表明，3种微生物与铀作用的机制不同.铀结合到细胞表面后，酵母菌以无机微沉淀和生物矿化为主，严重受损的活性小球藻及死亡的枯草芽孢杆菌可能主要是通过与壁膜的活性位点络合配位，以及进入到胞内赋存的方式，未见胞外沉淀和矿化产物，微生物与铀作用过程和产物有多种方式，推测这可能与3种微生物的壁膜结构［8］和代谢过程［7］有关.

3 结论

3.1 3种微生物对水体中铀（Ⅵ）都具有较好的吸附效果.在pH=5.0，初始铀浓度为10～350mgU/ L，投加量在0.06～1.12mgU/L（DW），25℃下吸附24h，酵母菌，小球藻，枯草芽孢杆菌对铀的最佳吸附率分别为97.19%、97.13%、98.03%；最大吸附量分别达到341.2、356.5、512.5mgU/g （DW）.

3.2 在等温吸附模型中，Langmuir模型可较好地描述酵母菌和小球藻对铀的吸附过程，相关系数分别为0.988、0.991，最大吸附量的理论值与实验值吻合较好，枯草芽孢杆菌对铀的吸附过程更适合Freundlich模型，R2=0.961，表明酵母菌和小球藻对铀的吸附属于单分子层吸附，枯草芽孢杆菌为多层吸附.

3.3 SEM-EDS分析表明，3种微生物对铀的吸附作用机理不同.随着吸附时间的延长，铀会在酵母菌表面和周围出现铀和磷的纳米片状矿化体及沉积物，小球藻和枯草芽孢杆菌则未在表面或周围产生铀的纳米结晶或沉淀；3种微生物与铀作用后均会引起细胞形态的变化，而枯草芽孢杆菌的形态被破坏得最早最严重，表明枯草芽孢杆菌对铀的耐受性最弱.

［1］Vogel M， Günther A， Rossberg A， et al. Biosorption of U （VI） by the green algae Chlorella vulgaris in dependence of pH value and cell activity ［J］. Science of the total environment， 2010，409（2）：384-395.

［2］Liu M X， Dong F Q， Yan X Y， et al. Biosorption of uranium by Saccharmyces cerevisiae and surface interactions under culture conditions ［J］. Bioresource Technolgy， 2010，101：8573-8580.

［3］冯颖思，宋 刚，祝秋萍，等.某铀矿下游水系沉积物剖面的放射性核素分布特征 ［J］. 中国环境科学， 2013，33（8）：1442-1446.

［4］彭国文，丁德馨，胡 南，等.纳米Fe3O4负载啤酒酵母菌对铀的吸附性能与机理 ［J］. 中国有色金属学报， 2012，22（2）：604-610.

［5］LI J， ZHANG Y. Remediation technology for the uranium contaminated environment： a review ［J］. Procedia Environmental Sciences， 2012，13：1609-1615.

［6］Mukherjee A， Wheaton Gh， Blum Ph， et al. Uranium extremophily is an adaptive， rather than intrinsic， feature for extremely thermoacidophilic Metallosphaera species ［J］. PNAS，2012，109：16702-16707.

［7］Bargar J R， Williams Kh， Campbell K M， et al. Uranium redox transition pathways in acetate-amended sediments ［J］. PNAS 2013，110：4506-4511.

［8］Cologgi D L， Pastirk S L， Speers A M， et al. Extracellular reduction of uranium via Geobacter conductive pili as a protective cellular mechanism ［J］. PNAS， 2011，108：15248-15252.

［9］Rashmi V， Shylajanaciyr M， Rajalakshmi R， et al. Siderophore mediated uranium sequestration by marine cyanobacterium Synechococcus elongatus BDU 130911 ［J］. Bioresour Technol.，2013，130：204-210.

［10］Lovley D R. Bioremediation. Anaerobes to the rescue ［J］. Science，2001，293（5534）：1444-1446.

［11］Lovley D R， Phillips E J P， Gorby Y A et al. Microbial reduction of uranium ［J］. Nature， 1991，350（6317）：413-416.

［12］Toshihiko O， Takahiro Y， Takuo O， et al. Interactions of uranium with bacteria and kaolinite clay ［J］. Chemical Geology，2005，220（3/4）：237-243.

［13］Toshihiko O， Takuo Ozaki， Takahiro Y， et al. Mechanisms of uranium mineralization by the yeast Saccharomyces cerevisiae ［J］. Geochimica et Cosmochimica Acta， 2005，69（22）：5307-5316.

［14］Jiang M Y， Ohnuki T， Tanaka K， et al. Post-adsorption process of Yb phosphate nano-particle formation by Saccharomyces cerevisiae ［J］. Geochimica et Cosmochimica Acta， 2012，93：30-46.

［15］Jiang M Y， Ohnuki T， Kozai N， et al. Biological nanomineralization of Ce phosphate by Saccharomyces cerevisiae ［J］. Chemical Geology， 2010，277（1/2）：61-69.

［16］Toshihiko O， Naofumi K， Fuminori S， et al. Association of actinides with microorganisms and clay： Implications for radionuclide migration from waste-repository sites ［J］. Geomicrobiology Journal， 2010，27（3）：225-230.

The adsorption behavior on uranium by three kinds of microorganisms.

MA Jia-lin1， NIE Xiao-qin1*， DONG Fa-qin1，DAI Qun-wei1， ZHANG Dong2， YANG Jie1， ZHOU Xian1， HUANG Rong1， GONG Jun-yuan1， GONG Yun-Jun1（1.Fundamental Science on Nuclear Wastes and Environmental Safety Laboratory， Southwest University of Science and Technology， Mianyang 621010， China；2.Institute of Nuclear Physics and Chemistry， China Academy of Engineering Physics， Mianyang 621900， China）. China Environmental Science， 2015，35（3）：825～832

To compare the similarities and differences of adsorption properties and adsorption properties during interaction of microorganisms with uranium， we selected Bacillus subtilis （bacteria）， yeast （fungus）， chlorella （algae） as objects and studied the adsorption performance and a variety of microbial factors by using scanning electron microscopy （SEM） and energy dispersive spectrometer （EDS）. The results indicated that three types of microorganisms in water uranium has good effect on uranium adsorption. The best adsorption rate of uranium by yeast and chlorella and Bacillus subtilis were 97.19%、97.13% and 98.03%， respectively. And the maximum adsorption capacity of uranium by yeast and chlorella and Bacillus subtilis were 341.2、356.5、512.5mgU/g（DW） ， respectively. The adsorption process and mechanism for uranium adsorption by three kinds of microbe was different， yeast and chlorella in line with the Langmuir model， bacillus subtilis is more suitable for the Freundlich model. The results of Scanning electron microscope and energy spectrum indicated that the uranium is adsorbed onto the cell surface at the beginning with no precipitation or mineral. Then， the sheet and clumps of uranium- phosphorus crystallization were formed on the surface of yeast after 12hours.however， There were not found the similar crystals on the surface of chlorella and bacillus subtilis. Interaction of microorganisms with uranium will cause changes in cell morphology， especially for bacillus subtilis and chlorella.

uranium；sorption；microorganism；mechanism

X591

A

1000-6923（2015）03-0825-08

马佳林（1993-），男，河南汝阳人，西南科技大学本科生，主要从事放射性污染生物修复方面的研究.

2014-07-05

国家自然科学基金资助项目（50578020）；国家自然科学基金委-中国工程物理研究院联合基金项目（11176028）；国家重点基础研究发展计划（973计划，2014CB846003）；核废物与环境安全国防重点学科实验室开放基金项目（12zxnp02）；西南科技大学创新基金项目（14ycx038）

* 责任作者， 讲师， xiaoqin_nie@163.com