陈艳　林琳　贾志强

高危型HPV载量 HIF-1α在CIN的表达及与LEEP术后患者的相关性分析

陈艳林琳贾志强

目的 探讨高危型人乳头状瘤病毒（HPV）载量及缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在宫颈鳞状上皮内瘤变（CIN）的表达及发病过程中的相关性。方法 行环状电圈切除术（LEEP）患者，CIN Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ级各50例，并选取同期体检健康女性50例为对照组，采用免疫组织化学方法检测HIF-1α的表达，采用HPV-DNA杂交捕获Ⅱ（HC-Ⅱ）方法检测高危型HPV-DNA，并用ROC曲线分析高危型HPV-DNA判断宫颈病变理想的RLU/CO界值。结果 高危型HPV RLU/CO值及多个性伴侣因素组间比较差异有统计学意义，HIF-1α在 CINI、II、III级中表达率分别为 26%、54 %、68%，呈现逐渐上升趋势，HIF-1α的阳性表达率与CIN分级成正相关（R=0.377，P=0.000），与HPV RLU/CO值成正相关（R=0.309，P=0.000）。Logistic回归分析，HPV载量、多个性伴侣、HIF-1α表达均为危险因素。ROC曲线分析，确定预测CINII、CINIII宫颈病变最佳RLU/CO值3.805，灵敏度81%，特异度79%，Youden指数=0.600。结论 高危型HPV载量及HIF-1α与CIN存在明显相关性，两者联合检测可以更准确地判断CIN病变程度及生物学行为，预测CIN病变最佳HPV载量为3.805。

宫颈上皮内瘤样病变 缺氧诱导因子-1α 乳头状瘤病毒 病毒负荷量 杂交捕获

宫颈癌是我国妇科恶性疾病死亡的主要原因之一，高危型人乳头状瘤病毒（HPV）感染是宫颈癌和宫颈上皮内瘤变（CIN）发生的必要条件，CINⅡ、Ⅲ患者术后高危型HPV载量与宫颈病变相关，近年来成为国内CIN患者经环状电圈切除术（LEEP）后的随访内容。缺氧诱导因子1 （HIF-1）是维持机体氧平衡的核心转录基因，是近年来肿瘤研究的热点。本文探讨高危型HPV载量判断宫颈病变CINⅡ、Ⅲ级理想的RLU/CO界值，进一步分析HIF-1α参与CIN的可能机制及作用。

1　临床资料

1.1一般资料 2009年6月至2013年1月本院行LEEP患者150例，选择同期体检健康女性50例为对照组，所有入选者年龄20～56岁，平均（39.97±9.67）岁。LEEP术患者均由同一位经验丰富的医师操作，以病理检查结果为最终诊断，所有病理切片均由资深病理学专家复核。按国际妇产科联盟（FIGO）诊断标准进行临床分期： Ⅰ级，Ⅱ级，Ⅲ级各收集50例。入选标准：既往无冠心病、脑血管病家族史、糖尿病、肝、肾、血液、自身免疫性疾病及妊娠者。本项目通过本院伦理委员会批准，所有标本的收集均经受试者本人或家属同意。排除标准：脑卒中、严重心脏疾病近期发生心肌梗死或心绞痛疾病、严重感染、严重肝、肾功能不全、血栓性疾病、肿瘤、曾行放化疗或生物学治疗患者。

1.2高危型HPV-DNA检测 高危型HPV-DNA检测采用美国Digene公司HPV-DNA杂交捕获Ⅱ（HC-Ⅱ）的方法，HC-Ⅱ试剂盒购自美国Digene公司。共检测13个高危HPV基因型，包括HPVl6、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68。操作严格按照试剂盒说明。

1.3HIF-1α表达的检测 HIF-1α表达的检测采用兔抗人HIF-1α单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），染色方法严格按照说明进行，显微镜下观察并计数阳性染色细胞数。HIF-1α主要表达于细胞核与细胞质，以棕褐色或棕黄色颗粒者为阳性，参考Swinson等［1］的判断标准，根据肿瘤细胞显色的比例及染色强度，对HIF-1α表达作半定量评定。参考肖帅等［2］研究，阳性细胞率评分：0分：阳性细胞数＜1%。1分：1%～10%。2分：11%～50%。3分＞50%。按显色程度评分：1分：染色弱。2分：中等染色。3分：强染色。两种评分结合起来分为4级：无论染色强度如何，细胞阳性率＜10%为阴性。2～3分为阳性（+）。4～5分为中度阳性（++）。6～7分为强阳性（+++）。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0软件分析。计数资料行χ2检验，等级资料行秩和检验，计量资料以（x±s）表示，用单因素方差分析。采用非条件多项式Logistic回归分析病毒载量、HIF-1α表达及其他多因素与各级CIN的关系。确定阈值采用ROC曲线，真阳性率与假阳性率之差为Youden指数，取最大Youden指数为HPV-DNA负荷的最佳阈值。

2　结果

2.1CIN高危因素的单因素分析 见表1。

表1　CIN高位因素的单因素分析［n，（x±s）］

2.2HIF-lα在宫颈上皮内瘤样变中的表达 HIF-1α的阳性表达率与CIN分级成正相关（R=0.377，P=0.000），与HPV RLU/CO值成正相关（R=0.309 P=0.000）见表2。

表2　HIF-1α在宫颈上皮内瘤变中的表达（n）

2.3Logistic 回归分析 采用二分类非条件Logistic回归分析HPV载量及HIF-1α表达与CIN高危因素的关系，将单因素分析筛选出的可能危险因素进一步进行多因素Logistic回归分析，最终进入模型的因 素：HPV载 量（OR=4.206，95% CI为1.826～9.691；P=0.001），多个性伴侣（OR=4.406，95% CI为1.942～9.997；P=0.000），HIF-1α表达（OR=2.457，95% CI为1.364～4.424；P=0.003）均为危险因素，见表3。

表3　HPV载量及HIF-1α表达与CIN高危因素的关系的logistic回归分析

2.4高危型HPV病毒载量预测宫颈病变阈值的确定 根据病理组织学结果，以健康体检人群及CIN I为阴性，CINII、III为阳性，高危HPV-DNA病毒载量预测CIN II、III宫颈病变阈值的ROC曲线，结果提示预测CINII、III宫颈病变，高危型HPV病毒载体最佳RLU/CO阈值为3.805，灵敏度81%、特异度79%，Youden指数=0.600。

3　讨论

HPV病毒感染后，仅少数患者HPV载量一直持续在较高的水平，并逐渐由量变发生了质变，感染细胞异常增生，直至出现形态学改变，导致宫颈癌。HPV感染是CIN发生、发展的必要条件，但并不是充分条件。有研究报道子宫颈暴露HPV病毒的载量和型别对于宫颈高度病变及子宫颈癌发生的致病风险至关重要［3］。本资料显示，宫颈病变中HPV感染率与HPV病毒负荷量均随着宫颈病变级别升高，随着HPV病毒负荷量的增高，宫颈病变程度越高；宫颈病变级别越髙。目前，CIN治疗方法主要为LEEP术［4］，LEEP术阳性切缘的患者25%～50%可能病灶残留或复发。

本资料应用杂交捕获HPV-DNA检测技术HC-Ⅱ法测定；有研究报道［5］HC-Ⅱ检测法在CIN II级以上，其宫颈病变敏感性＞90%，但其特异性偏低，门诊宫颈癌筛查其诊断意义不明确，不典型鳞状细胞分层特异性＜50%。而本资料结果提示，预测CINII级以上高危HPV-DNA病毒载量最佳值为3.805，灵敏度81%、特异度79%，Youden指数=0.600，分析其原因可能有：（1） HPV感染患者可通过体内免疫系统可自然消退。（2）HC-Ⅱ检测方法与其他低危型HPV基因有交叉反应，尤其是RLU/CO值＜2时其敏感性及特异性均受影响。故作者认为提高HPV-DNA阳性阈值至3.805可提高HC-II法检测的特异性，可降低其检测CIN II、Ⅲ级宫颈病变的假阳性率，而对其敏感性仅轻微影响。

近年来关于肿瘤发生、发展的影响因素的研究中，肿瘤细胞内部缺氧作为一个新的观点逐步引起重视。其发生机制可能为当肿瘤细胞缺氧时，通过对HIF-1α调节，从而影响细胞能量代谢、血管发生及舒缩的控制，继而介导血管内皮生长因子、红细胞生成素、糖酵解酶等多个基因的转录［6］，诱导新生血管生成，使肿瘤细胞适应缺氧微环境。HIF-1α在 CINI、II、III 中阳性表达呈逐渐上升趋势。在组织学分级，HIF-1α的阳性表达率与CIN分级成正相关（R=0.377），与HPV RLU/CO值成正相关（R=0.309），因此作者认为，临床上对HIF-1α蛋白的检测将有助于子宫内膜改变的诊断及鉴别诊断，且与HPV病毒载量成弱正相关关系，能够预测肿瘤的发展趋势和转移潜能，有望成为一种新的临床诊断指标。

1Swinson DE，Jones JL，Cox G，et al. Hypoxia-inducible factor-1 alpha in non small cell lung cancer， relation to growth factor， protease and apoptosis pathways. Int JCancer，2004，l 11（1）：43.

2肖帅，卢先州，刘龙飞，等. 缺氧诱导因子-1α及转录因子Snail与直肠癌侵袭转移及预后的关系. 中华实验外科杂志，2012，29（2）：212-213.

3Gravitt PE， Kovacic MB， Herrero R， et al. High load for most high risk human papillomavirus genotypes is associated with prevalent cervical cancer precursors but only HPV16 load predicts the development of incident disease. Int J Cancer.2007， 121（12）：2787～2793.

4余进进，舒珊，王元，等. 腹腔镜辅助阴式根治性子宫切除术治疗宫颈癌的临床研究.中国医师杂志，2011， 13（6）：329～330

5Ordi J1， Puig-Tintoré LM， Torné A， et al. Contribution of high risk human papillomavirus testing to the management of premalignant and malignant lesions of the uterine cervix Med Clin ， 2003，121（12）：441～445.

6Kelly B D，Hackett S F，Hirota K，et al . Cell type-specific reguiation of angiogenic growth factor gene expression and induction of angiogenesis in nonischemic tissue by a constitutiveiy active form of hypoxiainducibie factor1. Circ Res，2003，93（11）：1074～1081.

浙江省瑞安市科技计划项目（201102060）

325200浙江省瑞安人民医院妇产科