赖怡　张怡　刘肖珩★　曾烨　吴江

·基础研究·

组合培养下Hep-2对EPCs的影响

赖怡张怡刘肖珩★曾烨吴江

目的 探讨喉鳞癌细胞与内皮祖细胞组合培养后对两种细胞的影响。方法 在组合培养后，观察内皮祖细胞的细胞增殖、凋亡、细胞周期以及成血管能力变化。通过免疫组化检测细胞表面分子标注物的变化。结果 在与喉鳞癌细胞组合培养后，内皮祖细胞的细胞增殖和凋亡均增加，上调细胞表面标志物。喉鳞癌细胞Fascin-1表达上调，内皮祖细胞的成血管能力加强。结论 内皮祖细胞与喉鳞癌细胞组合培养可以导致细胞生物学特性和成血管能力的变化，从而促进肿瘤血管生成。

Fascin-1 组合培养 喉鳞癌细胞 内皮祖细胞 肿瘤血管生成

喉鳞癌是一种常见的头颈部恶性癌症，在大部分病例中治疗疗效较差［1］。肿瘤微环境，能够促进血管和细胞外基质生成，诱导肿瘤细胞的迁移，研究透彻其相关因素将有助于肿瘤治疗［2］。循环祖细胞如内皮祖细胞［3］、胚胎祖细胞均参与内皮细胞介导的新生血管形成过程中。作者自2011年1月至6月采用喉鳞癌细胞（Hep-2）与内皮祖细胞（EPCS）组合培养后，观察内皮祖细胞在组合培养后细胞生物特性和细胞成血管、迁移能力的变化，探讨EPCs对肿瘤血管新生的作用和在抗癌治疗中的潜在作用。

1　材料与方法

1.1实验动物 Beagle实验用犬，雌性，成年，四川大学华西医院动物实验中心提供。

1.2主 要 试 剂 Transwell小 室（Costar，USA）；EBM-2培养液（Lonza，USA）；MPA、淋巴细胞分离液，均购自Sigma USA。CD34、CD133、VWF、VEGR-2购自Santa Cruz USA。

1.3EPCs的分离培养和鉴定 无菌抽取犬骨髓5ml，肝素抗凝，置于淋巴细胞分离液（1.077）上，密度梯度离心（2113r/min，25min）。吸出离心后的单个核细胞层，PBS洗涤两次（1494r/min，10 min），以EBM-2重悬细胞，接种于FN预包被的培养瓶中，37℃、5%CO2培养。4d后首次换液，以后换液1次/3d，待细胞长至90%汇合后传代并检测其表面标志因子CD34、CD133、VWF。本实验采用3～5代细胞。

1.4细胞增殖、细胞周期和凋亡检测 取对数生长期细胞加入96孔（2.5×103/孔）板中，检测EBM-2培养基和M199（10%胎牛血清）培养液情况下细胞增殖情况。MTT法测定吸光度值（OD），连续7d，绘制EPCs的生长曲线。EPCs细胞以5×105/孔接种于6孔板中，48h后收集细胞，70%冰乙醇固定后加入碘化丙醇（PI）染色，流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率。

1.5Transwell组合培养 在上室或下室分别接种Hep-2 或 EPCs，在各自生长融合后，进行组合培养。设置对照组，组合培养后分别进行免疫组化、细胞周期和细胞凋亡及体外血管形成实验。

1.6体外血管生成实验 Matrigel （100 μl） 接种到24孔板中，在37℃ 孵化30 min 。EPCs 细胞消化重悬后，加至铺设Matrigel的孔板中。在不同时间段观测评价血管形成情况，评价显微镜下三个随机区域毛细血管样管状结构的数量。

1.7细胞迁移试验 取对数生长期细胞4×104/孔接种于Transwell上室中。置于恒温培养箱内孵育24h。用棉签小心刮除未迁移过膜的细胞，4%多聚甲醛固定20 min，0.2%结晶紫染色后于光学显微镜下观察，随机取10个视野计数迁移过膜的细胞。

1.8统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件。计量资料均以（x±s）表示，采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1喉鳞癌组织、脐带及内皮细胞免疫组化情况 见图1。

图1　喉鳞癌组织、脐带及内皮细胞免疫组化情况

2.2EPCs细胞的分离、培养、鉴定及其生物学特性（1）倒置显微镜下观察细胞生长情况：刚分离的细胞多呈圆形，周围有较多血细胞，较难分辨出 EPCs，在各种内皮系生长因子的作用下，随培养天数增加，在培养瓶中的贴壁细胞形态开始出现改变，形成内皮样细胞，按照条索状分布，逐渐形成集落，从而细胞进入对数增长期（见图2A）。（2）细胞鉴定：免疫细胞化学的结果，表明所分离的细胞表达CD133、CD34、VEGFR-2。EPCs可摄取乙酰化低密度脂蛋白（ac-LDL）并与荆豆凝集素－1（UEA-1）反应（见图2B）。用红色荧光标记的是 DiI-acLDL，用绿色荧光表示 FITCUEA-1 染色情况。分离出来的细胞均表达这两种蛋白，为正在分化的EPCs（见图2C）［4］。（3）MTT法绘制细胞生长曲线：若仅在M119中添加VEGF等一系列生长因子，EPCs从2 d起较采用EBM-2培养的细胞生长明显落后。尽管生长明显减缓，但各组细胞仍可以在5d达到生长的高峰期，在此后的时间内，生长速度开始逐渐下降。细胞接种密度同样也可以影响细胞成长情况。当EPCs接种密度为105，在同等情况下（M199或EBM-2），细胞生长均显著高于接种密度为104的细胞。值得关注的是，接种密度为104且采用EBM-2培养的EPCs，可以见到在5d后，细胞均数仍在增长（见图2D）。（4）体外血管生成：显示细胞接种不同时间后，体外血管形成的情况。接种后0 h，细胞悬浮在培养液中，分布较均匀接种。＞1h，细胞形态无明显变化。接种＞2h，在Matrigel不同层面，逐渐贴壁，向周围延伸，细胞间形成连接。接种＞4h，可有血管网络的形成。接种8h后，细胞相互接触更为显著，逐渐形成小的血管分支。接种＞12h后，Matrigel各层均有管状连接形成，可认为EPCs形成血管的能力较强，并在三维空间上生长并延伸（见图2E）。

图2　EPCs细胞生物学特性检测

2.3组合培养后EPCs和Hep-2细胞的生物学特性变化。（1） 组合培养后EPCs和Hep-2细胞形态的变化：组合培养1 d后，EPCs 的细胞形态较之前有明显变化，细胞变得细长，胞浆减少，随着培养时间增加，EPCs 的形态继续变化，胞浆持续减少，至组合培养第4 d，细胞形态变化最为显著。Hep-2 细胞的变化较之前并无显著性变化（图3A）。（2） 组合培养后EPCs和Hep-2细胞周期和细胞凋亡的变化：组合培养后 EPCs的 PI 较单独培养的EPCs 有显著性增高（P＜0.05）；组合培养后 Hep-2 的 PI 较单独培养的Hep-2的PI有显著性增高（P＜0.01）。以上结果表明，在组合培养后，EPCs、Hep-2 两种细胞增殖均明显增加，Hep-2 的增殖更为显著。组合培养后 EPCs 的 AI 较单独培养的 EPCs 有显著性增高（P＜0.01）；同时，组合培养后 Hep-2 的 AI 较单独培养的 Hep-2 的 AI 有显著增高（P＜0.01）。以上结果表明，在组合培养后，EPCs、Hep-2 两种细胞发生凋亡明显增加，Hep-2 的凋亡更为显著。（3）组合培养后EPCs和Hep-2细胞表面标志物的变化：在组合培养后EPCs表面标志物发生变化：CD133的表达略有减弱，而CD 34和VEGFR-2的表达增强。组合培养后Hep-2中Fascin-1的表达较之前显著增加（P＜0.01），意味着组合培养可上调Fascin-1的表达。（4）组合培养后EPCs体外血管生成情况变化：在接种4 h后，细胞间开始出现连接趋势；在5 h，细胞开始逐渐形成网状结构；到7 h可见这些细胞形成网状结构，且并不局限于一个层面，而是在多个层次上延伸；到8 h血管结构已经非常明显。

3　讨论

Fascin 是一种关键的肌动蛋白结合蛋白，结合粘附在丝状伪足上。Fascin在较多肿瘤中表达增高如乳腺癌、肺癌、子宫癌等，并引起肿瘤细胞的形态学变化，主要是源于对膜突起和迁移特性的加强［5，6］。研究表明，Fansin-1在喉鳞癌转移和复发中起着重要作用［7］。喉鳞癌组织切片结果表明，Fascin-1的表达与喉鳞癌分化程度有关。Fascin-1可能会在喉鳞癌的肿瘤微环境的形成及发展过程中发挥作用。因此，有必要研究Hep-2 与EPCs组合培养后，两种细胞生物学特性以及 Fascin-1 表达的变化。

组合培养3 d之后，EPCs的细胞形态发生显著改变，而Hep-2在整个过程中变化不大。因此采用组合培养3 d后的EPCs和Hep-2用于实验。EPCs 具有体外成血管能力，在接种4 h后开始出现网状结构，在后续时间内逐渐增强连接，并在凝胶各层形成网状结构，12 h后细胞趋于融合。而组合培养后，EPCs的血管生成情况发生变化，一旦细胞接触形成，迅速形成网状结构，并在各个层面延伸。到8 h时，细胞已趋于融合。这意味着，组合培养可促进EPCs 的成血管能力。

在EPCs和Hep-2组合培养后，PI和AI均较单独培养组有显著性差异，意味着组合培养可使两种细胞的增殖和凋亡均增加。尽管组合培养可以同时影响细胞增殖和细胞凋亡，但数据显示，细胞凋亡的程度较细胞增殖程度更为显著。

组合培养可导致EPCs细胞表面标志物表达发生改变：CD133表达减弱，CD34和VEGFR-2表达增强，意味着组合培养可使EPCs从祖细胞向成熟内皮细胞分化［8，9］。可能是由于组合培养过程中，Hep-2分泌相关因子影响EPCs的增殖、凋亡、细胞表面标志物以及成血管能力。

组合培养后，Hep-2中Fascin-1的表达增强，即组合培养可使Hep-2侵袭性增强。可能是组合培养情况下，EPCs通过分泌相关因子对Hep-2产生影响。国内研究结果表明，采用EPCs与其他细胞组合培养，有促进其他细胞增殖的作用［10，11］，在使用VEGF抗体后将拮抗相关作用［12］。

本资料结果表明，Fascin-1可在高分化喉鳞癌、脐带及内皮细胞中表达；EPCs与Hep-2组合培养可使两种细胞增殖和凋亡增强；EPCs体外成血管能力增强；EPCs从祖细胞向成熟内皮细胞分化，Hep-2中Fascin-1的表达增强。因此，EPCs和Hep-2组合培养后，可改变两种细胞的细胞生物学特性及Fascin-1的表达。因此，采用组合培养方式来分析Hep-2与EPCs在喉鳞癌发生发展中作用是切实可行的，为进一步在组合培养系统中研究喉鳞癌血管生成和侵袭的分子机制提供实验依据。

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Aim In the present study，laryngeal squamous cell carcinoma cells were co-cultured with endothelial progenitor cells in transwell chamber experiments to investigate the infl uence of co-culture on both cell types. Methods After co-culturing，proliferation，apoptosis，cell cycle and tube formation by endothelial progenitor cells were measured. Changes in expression of cell surface markers and Fascin-1 were detected by immunocytochemistry. Results Both the proliferation and apoptosis indices increased in endothelial progenitor cells and laryngeal squamous cell carcinoma cells after co-culture. Co-culturing upregulated the expressions of endothelial progenitor cells surface markers. Fascin-1 expression in laryngeal squamous cell carcinoma cells was increased and the angiogenic capacity of EPCs was enhanced. Conclusion Co-culture of endothelial progenitor cells with laryngeal squamous cell carcinoma cells induces changes in biological characteristics and angiogenic capacity，thereby promoting tumor angiogenesis.

Fascin-1 Co-culture Laryngeal squamous cell carcinoma EPCs Tumor angiogenesis

国家自然科学基金No 81201477，10972148

610091成都市妇女儿童中心医院中心实验室（赖怡）610041 四川大学华西医院西部妇幼研究院围生医学实验室（张怡）610041四川大学基础医学院生物医学工程实验室（刘肖珩 曾烨 吴江）