田祥学

（黄冈市食品药品监督检验中心，湖北 黄冈 438000）

细菌内毒素检查法及其在药品检验中的应用

田祥学

（黄冈市食品药品监督检验中心，湖北 黄冈 438000）

注射用药品对于热原质的检查传统方法是家兔法。细菌内毒素检查法相对于传统方法有灵敏度高、操作简便等诸多优点。鲎试验法检测细菌内毒素的技术，由于其快捷、灵敏、经济、可标准化等优点可带来良好的经济及社会效益，中、美、英、日等国的药典均有收载，是现行常用的细菌内毒素检查法之一。

细菌内毒素；药品检验；鲎试验法

1　基本原理

细菌内毒素，英文称作Endotoxin，是革兰阴性菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。静脉注射用药品所含细菌内毒素超过一定的浓度会使人体体温升高发生热原反应，对用药安全产生影响。鲎试验法检查细菌内毒素是美国科学家Levin和Bang1968年所建立的［1］。研究表明，细菌内毒素可以激活鲎试剂中鲎血细胞溶解物一系列凝集酶的反应，形成肉眼可见的凝固蛋白凝胶。利用这一原理用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。

2　细菌内毒素检查法

2.1内毒素标准品：细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品效价。细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。每1ng工作标准品效价应不小于2EU，不大于50EU，并具备均一性和稳定性的实验数据。

2.2实验准备：将玻璃器皿放入酪酸洗液或其他热原灭活剂或清洗剂中充分浸泡［2］，然后控干洗液，用蒸馏水冲洗3遍以上；置入干燥箱，在250 ℃干烤30 min以上，以除去可能存在的外源性内毒素的干扰。

2.3鲎试剂灵敏度复核：根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），利用漩涡混合器将细菌内毒素标准品与专门的检查水混合溶解15 min，逐级2倍稀释，并计算鲎试剂灵敏度测定值（λC）。灵敏度检验复核严格执行于每批新的鲎试剂。此外稀释倍数加大的试剂可进行不干扰试验可以排除干扰因素的影响。

2.4实验方法：取4支试管，分别加入鲎试剂0.1 mL，再分别加细菌内毒素检查用水0.1 mL溶解。其中2支加入按最大稀释倍数稀释的供试品溶液0.1 mL作为供试品管，1支加入2λ内毒素工作标准品溶液0.1 mL作为阳性对照管，1支加入细菌内毒素检查用水0.1 mL作为阴性对照管。将试管混匀封口后置于（37±1） ℃水浴保温1 h［2］。取出慢慢倒转180°观察，若管内凝胶附着管壁无明显改变记为阳性（+），否则记为阴性（-）。供试品两管均为（-），应认为符合规定。

2.5实验中的注意事项：实验前需用肥皂洗手，用75%乙醇棉球消毒［2］；移液管取样时要注意防止气体混入；反应过程中避免试管震动，以免凝胶破碎造成假阴性结果；灵敏度复核及干扰试验时两组应同时进行；实验操作应该在清洁环境中进行，防止微生物污染。

3　与传统方法对比

我们从方法的用时，操作难度、成本、灵敏度及标准化难度几个方面与传统家兔法进行对比，不难看出它的优点。见表1。

表1　鲎试剂法与家兔法对比

4　细菌内毒素检查法的应用

1980年美国药典最先收载了凝胶法，并作为仲裁法分别应用美欧日等多国的药品检验。随后动态浊度法、显色基质法、电泳法、酶联免疫等应用有了较快的发展，其优点在于降低了无关干扰且检查速度较快。方法的自动化在不断发展，动态显色基质法和动态浊度法已实现仪器自动化检测并进行数据处理，美国LAL4000、日本的Toxinometer201以及我国的BET-32型细菌内毒素测定仪［3］相继出台。另外，细菌内毒素检验梭鱼的试剂量及样品量要求在不断降低，如酶联免疫吸附法，所需的鲎试剂只需要凝胶法的百分之一，且具有更好的灵敏度和抗干扰能力［4］。

我国1991年首次收入部颁标准，1995年正式收载于中国药典二部附录，近20年来每版药典收载细菌内毒素检查的药品都在成倍增长，中、美药典收载品种情况见表2。

表2　中、美药典收载细菌内毒素检查数量情况对比

从对比情况来看，我国现行药典收载品种数已经接近美国药典25版水平。同时在药品生产的质量控制和药品检验中已广泛应用于化学制剂、抗生素、原料药及生物制剂，对中药注射用的应用研究也在进行之中。

5　影响发展的因素与对策

不同药物具有不同的特性，细菌内毒素检验法在药品检验中有明显局限性。在药品检验过程中不仅要对每类药品的各自特性进行全面分析，还要对药品的每种成分进行毒性试验，对于不同药品的相互作用进行检验；随着药品种类的不断增多以及药品药效的差异性增大，对于药品检验技术的要求也日益增高。细菌内毒素检查法在实验的具体操作中必须尽量避免杂菌的干扰，然而实际操作中很难做到。因此需要对检验技术进行不断改进。要加强培养优秀的检验技术人，要探索比凝胶法更全面的检验方法，加强相关研究，并及时更新检验设备，提高方法的应用价值。

6　总 结

细菌内毒素检查法已被多国药典收载，通过方法学验证，越来越多的药品采用这种方法取代传统的家兔法，我国药典自2000年版以来不断增加细菌内毒素检查的品种，2010年版药典还对用于无菌分装静脉用注射剂的原料药增加了细菌内毒素的控制，同时还扩展到了生物制剂的应用。目前国外细菌内毒素定量法的使用率达到65%以上，超过了凝胶法，与国外相比还存在一定的差距。随着我国经济的快速发展，技术研究的不断深入，检验检测仪器设备的更新换代，以及广大医药工作不懈努力，相信细菌内毒素检查法的在药品检验中的应用领域与检验技术将得到更加广泛的发展，不久将赶超世界先进水平。

［1］肖贵南，孙清萍，盛英美，等.如何建立新药的细菌内毒素检查方法［J］.中国医药导报，2011，8（32）:159-160.

［2］中国药品检验标准操作规程［S］.2010.

［3］唐先明，何志一，刘建辉，等.热原检查用兔细菌内毒素敏感性研究［J］.黑龙江医药，2014，27（1）:1052-1055.

［4］孙哲.细菌内毒素检验［J］.世界最新医学信息文摘（电子版），2012，（9）:128.

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1671-8194（2015）23-0278-02