骨炎败毒丸的微生物限度检验法验证

2015-10-25陈君

中国医药指南 2015年20期

关键词：检查法本品限度

陈君

（襄阳市食品药品监督检验所，湖北襄阳 441100）

骨炎败毒丸的微生物限度检验法验证

陈君

（襄阳市食品药品监督检验所，湖北襄阳 441100）

目的建立骨炎败毒丸的微生物限度检验法。方法按中国药典2010年微生物限度检查验证方法的验证，以回收率对方法有效性进行评价。结果采用常规法，5种阳性菌的回收率均＞70%，控制菌验证试验均为阳性。结论骨炎败毒丸其中药成分在微生物限度检查时不会干扰检查结果，不具有抑菌活性，常规法用于骨炎败毒丸的微生物限度检查可行性强，垂直操作简单易行，结果准确，可用于骨炎败毒丸的微生物限度检验。

骨炎败毒丸；微生物限度检查；验证；培养基稀释法；回收率

本品为襄阳市夏绿二骨炎风湿病专科门诊部自制制剂，有金银花、蒲公英、苦地丁、连翘、黄柏等一共15味中药制成，具行气活血，化瘀通滞，清热解毒的功效，用于急慢性骨髓炎，慢性化脓性骨髓炎，慢性硬化性骨髓炎，化脓性关节炎，一切化脓性炎症［1］。其方中金银花具有清热解毒，疏散风热。用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热［2］。其质量控制一直使用其门诊部自制标准，原质量标准中无微生物限度检查法的具体检验方法，产品内在质量得不到保证，本研究拟对骨炎败毒丸的微生物限度检查方法进行验证，最终确认对本品最科学的方法，为保证本品的质量提供定量方法学实验依据［3］。

1　仪器与试药

骨炎败毒丸（襄阳市夏绿二骨炎风湿病专科门诊部，20131002，60克/瓶），菌种包括大肠埃希菌［CMCC（B）44102］；金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］；枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］；白色念珠菌［CMCC（F）98001］；黑曲霉［CMCC（F）98003］均购自中国药品生物制品检定所。培养基：营养肉汤（130522）营养琼脂培养基（130521）、玫瑰红钠琼脂培养基（130627）、胆盐乳糖培养基（130421）、改良马丁琼脂培养基（130607）、改良马丁液培养基（130522）。仪器：电热恒温干燥箱（202-2），立式灭菌器（LMQ.C）。

2　方法与结果

2.1菌液的制备

2.1.1分别将5种菌种接种至斜面培养基上培养。

2.1.2分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至50 mL营养肉汤中；白色念珠菌至改良马丁琼脂培养基上，以上4种菌均培养24 h。

2.1.3黑曲霉至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养5 d，加入3 mL含0.05%聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液至无菌试管内。

2.1.4以上5种培养好的菌，分别用相应的稀释溶液按10倍递增稀释法稀释，制成含菌数为50～100 cfu/mL的菌液。

2.1.5所有菌液临用现制并均放置于冰箱冷藏。24 h内使用。

2.2适用性检查：按中国药典2010年版一部附录XIIIC微生物限度检查法项下计数培养基适用性检查法操作，每个菌种在其对应的培养基平行做2个平皿，培养相应的时间后计数，本次试验所用养基上的菌落平均数均大于对照培养基上的菌落平均数的70%，菌落形态大小均与对照培养基上的菌落一致。培养基的适用性检查通过。

2.3供试液的制备：取本品10 g，加稀释液至100 mL，用匀浆仪2挡 1 min打碎混匀，做为1∶10的供试液，按递增稀释法制成1∶10、1∶102、1∶103共3个稀释级的供试液。

2.4计数方法的验证

2.4.1细菌、霉菌及酵母菌验证试验［4］。①实验组：取1∶103供试液1 mL和制备好的的实验菌液1 mL，每种实验菌平行制备2个平皿，分别加相应的培养基，按平皿法测定其菌落数。②菌液组：此组只加菌液，不加供试品，按实验组的方操作计数。③供试品对照组：按中国药典2010年版一部附录XIIIC微生物限度检查法——菌落计数法测定本品菌数，3个稀释级别每种培养基平行制备2个平皿。④稀释剂对照组：此组用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试品，按实验组的方操作计数。⑤阴性对照组：中国药典2010年版一部附录XIIIC微生物限度检查法项下计数方法验证中，未加入阴性对照组，此次试验笔者首次提出应加入阴性对照组，以增加验证的准确性和严谨性。试验用每种培养基均制备2个平皿，只加稀释液，注入培养基后依法培养计数。阴性对照组均无菌落生长。

以上实验共进行3次独立的平行试验。计算菌数回收率。菌数回收率见表1。稀释剂对照组和实验组对5种试验菌的回收率均＞70%。说明本次试验制备供试液和计数的方法适用于骨炎败毒丸的微生物限度检验法。

2.4.2控制菌检查方法的验证：取1∶10稀释级的供试液10 mL及1 mL含菌数为50～100 cfu的大肠埃希菌实验菌液分别接种至胆盐糖培养基和乳糖胆盐发酵培养基中，按中国药典2010年版一部附录XIIIC微生物限度检查法项下大肠埃希菌和大肠菌群检查法进行检查，结果均为阳性。说明常规法即可适用于本品的控制菌检查。同细菌、霉菌及酵母菌计数验证一样，本次试验，笔者也增加了阴性对照组，依法培养后均无菌生长。

3　讨论

由验证结果可知，本品微生物限度采用常规法，对5种试验菌的回收率均＞70%，且控制菌验证结果大肠埃希菌及大肠菌群均为阳性，说明本品中含有的中药成分不具有抑菌活性，不会干扰微生物限度检验结果，采用常规法即适用于本品的微生物限度检查。此次验证，确立了骨炎败毒丸的微生物限度检查方法，为今后本制剂的质量控制提供了有力的科学证据。同时，本次验证，笔者首次提出在依照中国药典2010年版一部附录XIIIC微生物限度检查法验证同时，增加阴性对照组，使实验结果更具有说服力和科学性。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.北京:化学工业出版社，2010:231.