许 宁 万英明

（吉林医药学院附属医院口腔科，吉林 吉林 132013）

rhIL-1α、1，25-（OH）2D3对人牙周膜成纤维细胞表达RANKL和OPG的影响研究

许 宁 万英明

（吉林医药学院附属医院口腔科，吉林 吉林 132013）

目的 研究rhIL-1α、1，25-（OH）2D3对人牙周膜成纤维细胞表达RANKL和OPG的影响。方法 将人牙周膜成纤维细胞分别放在含有纯培养液、含rhIL-1α培养液、含1，25-（OH）2D3培养液和含有rhIL-1α、1，25-（OH）2D3联合培养基中培养，并分别标记为D组、A组、B组和C组，培养48 h后，用荧光定量RT-PCR技术检验。结果 A组培养基中细胞表达RANKL和OPG均有上升，且RANKL/OPG比值也增加；B组培养基中细胞表达RANKL上升，但OPG下降，RANKL/OPG比值下降；C组培养基中RANKL上升，但对RANKL/OPG无明显影响。结论 rhIL-1α、1，25-（OH）2D3对人牙周膜成纤维细胞表达RANKL和OPG有较大影响，且rhIL-1α、1，25-（OH）2D3联合使用时对RANKL起到了协同作用。值得临床进一步探究。

rhIL-1α；1，25-（OH）2D3；人牙周膜成纤维细胞；表达RANKL和OPG；影响

近年来，越来越多的人选择进行固定修复及牙齿矫正。固定修复中基牙稳定性与牙周膜质量密切相关，而牙齿矫正就需要牙槽骨的改建，此改建过程极为复杂，除了成骨、破骨细胞的参与外，还有许多牙周膜成纤维细胞也起到了重要作用［1］。人牙周膜成纤维细胞依靠着表达RANKL和OPG来影响骨细胞的活动，二者为破骨细胞的终末因子，调控着破骨细胞的分化、激活和成熟。近期研究发现rhIL-1α、1，25-（OH）2D3与人牙周膜成纤维细胞表达RANKL和OPG有一定的关系。因此，笔者通过研究rhIL-1α、1，25-（OH）2D3对人牙周膜成纤维细胞表达RANKL和OPG的含量调节来为进一步进行牙齿矫正及固定修复提供更加合理的方法。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：此次试验所需要的仪器有Trizol试剂（由康为世纪股份有限公司提供）、氯仿（由淄博卓凯经贸有限公司提供）、乙醇（由国药集团化学试剂有限公司提供）、RT-PCR试剂盒（上海谱振生物科技有限公司提供）、SYBR荧光染料（由华美瑞康国际生物技术研究中心提供）、DEPC（上海如吉生物科技发展公司提供）、引物（由国药集团化学试剂有限公司提供）、10 μg/L rhIL-1α、1×10-8mol/L 1，25-（OH）2D3等。

1.2 人牙周膜成纤维细胞的培养与鉴定：培养材料均来自于临床上12岁左右青少年因正畸需要拔除的第一或第二前磨牙，且牙齿无任何损伤及其他疾病。将牙体放入培养液中，采用组织块培养法将组织与细胞分离，培养液每3 d更换一次。取第三代人牙周膜成纤维细胞进行标记和染色，对细胞进行鉴定。将4～7代人牙周膜成纤维细胞作为实验材料。实验过程中按照合适的密度将细胞培养在65 cm2的培养基中，观察细胞的生长和贴壁情况。代细胞完全贴壁后，吸取原有培养液，按分组进行诱导刺激，A组内加入rhIL-1α，B组内加入1，25-（OH）2D3，C组内加入rhIL-1α、1，25-（OH）2D3，D组不加入任何试剂，培养48 h后进行荧光测定。

1.3 荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ-RT-PCR）检测RANKLmRNA和OPGmRNA的表达：①引物合成与设计见表1，由上海英俊公司合成。②细胞总RNA的提取与检测：按照Trizol试剂盒的方法提取总RNA，凝脂糖凝胶电泳观察RNA质量。③cDNA第一条链的合成在PCR管中加入RNA模板5 μL、Primer（50 mol/L） oligio（t）1 μL、dNTP Mix（10 mol/L） 1 μL、再加入DEPC水形成10 μL的Mixture1；65 ℃水浴5 min，然后立即放冰2 min；在10 μL的Mixture 1中加入10×RT butter 2 μL、镁离子（25 mmol/L）4 μL；0.1 mol/L dTT 2 μL、RNaseout （40 U/μL） 1 μL、SuperScrip Ⅲ RT（200 U/μL） 1μL组成20 μL的体系，进行反转录反应。反应条件为50 ℃处理50 min，85 ℃处理5 min立即放置到冰上，在每管反应体系中加入1 μL的RnaseH 37 ℃处理20 min即获得cDNA。可以放到-20 ℃冰箱中保存。④荧光定量PCR扩增。PCR扩增技术中RNAKL反应过程为：95 ℃预变性2 min→95 ℃变性10 s→60 ℃退火20 s→72 ℃延伸45 s，共40循环；OPG反应过程为：95 ℃预变性2 min→94 ℃变性15 s→60 ℃退火30 s→70 ℃延伸30 s，共40循环，反应后进行曲线分析。

表1 扩增片段所用引物

1.4 统计学方法：采用SPSS13.0软件进行数据处理，资料采用χ2检验，P＜0.05有差异，P＜0.01有显著差异，P＞0.05无差异。

2 结 果

2.1 48 h后各组RANKL和OPG的比较：经过48 h培养后可以发现，D组培养基中无明显变化；A组培养基中细胞表达RANKL和OPG均有上升，且RANKL/OPG比值也增加；B组培养基中细胞表达RANKL上升，但OPG下降，RANKL/OPG比值下降；C组培养基中RANKL上升，但对RANKL/OPG无明显影响。见表2。

表2 四组培养皿中表达RANKL、OPG和RANKL/OPG的比较

将A、B、C三组与D组进行比较，对比表达RANKL时：A组和D组比较t=4.8371，P=0.0008；B组和D组比较t=3.6742，P=0.0010；C组和D组比较t=24.4107，P=0.0000。对比表达OPG时：A组和D组比较t=22.0895，P=0.0000；B组和D组比较t=1.6675，P=0.0032；C组和D组比较t=1.6675，P=0.0153。对比表达RANKL/OPG时：A组和D组比较t=.9954，P=0.0037；B组和D组比较t=29.7945，P=0.0000；C组和D组比较t=1.0547，P=0.3284。

3 讨 论

白细胞介素最初是由白细胞产生又在白细胞间发挥作用，所以由此得名，现仍一直沿用。最初是指由白细胞产生又在白细胞间起调节作用的细胞因子。现在是指一类分子结构和生物学功能已基本明确、具有重要调节作用而统一命名的细胞因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。RHIL-1α属于白细胞介素-1，其又称重组人白细胞介素-1α，是一种具有广泛生物学活性的破骨细胞活化因子，是由活化的单核巨噬细胞产生，具有免疫调节和发生内分泌反应的作用，还可以促进人牙周膜细胞参与骨吸收活动。在以前的研究中发现重组人白细胞介素-1α可以影响成骨细胞的转录，本次试验则可以证明重组人白细胞介素-1α对人牙周膜成纤维细胞表达RANKL和OPG也有显著效果。它可以将二者同时上调。

1，25-（OH）2D3又名1，25二羟基维生素D3。正常情况下，1，25二羟基维生素D3由它的前体25-羟胆固化醇在肾脏合成。人体每日生理合成的1，25二羟基维生素D3为0.5～1.0 µg。在骨形成活跃时期（例如生长或妊娠期），其合成量也略有增加。1，25二羟基维生素D3能促进肠道对钙的吸收，并且调节骨质的钙化。对于严重肾功能衰竭，特别是长期接受血液透析治疗的患者，内源性骨化三醇的合成明显减少甚至完全停止。在研究可以发现，在1，25二羟基维生素D3培养基中培养的细胞表达RANKL上升，但OPG下降。说明这种因素有利于破骨细胞的生成，促进了牙槽骨的吸收。

从本次实验中可以看出，A组培养基中细胞表达RANKL和OPG均有上升，且RANKL/OPG比值也增加（P＜0.05）；B组培养基中细胞表达RANKL上升（P＜0.05），但OPG下降（P＜0.05），RANKL/OPG比值下降（P＜0.05）；C组培养基中RANKL上升（P＜0.05），但对RANKL/OPG无明显影响（P＞0.05）。因此可以看出，重组人白细胞介素-1α和1，25二羟基维生素D3与人牙周膜成纤维细胞表达RANKL和OPG有密切的关系。

目前，重组人白细胞介素-1α和1，25二羟基维生素D3是一个调节人牙周膜成纤维细胞表达RANKL和OPG的有效预诊手段，且此类检测操作方便、成本低廉［5］。通过试验可以得知重组人白细胞介素-1α和1，25二羟基维生素D3与人牙周膜成纤维细胞表达RANKL和OPG有密切的关系，但二者联合使用时对RANKL/OPG既无明显增加也无没明显下降的变化，所以研究具体原因及相关调节机制将是我们下一步研究的重点。

［1］ 张兰，孙琳琳，丁岩，等.IL-1β对人牙周膜成纤维细胞OPG、RANKLmRNA表达的影响［J］.牙体牙髓牙周病学杂志，2012，22（8）: 440-441.

［2］ 陈良娇，兰泽栋，陈建明.rhIL-1α、1，25-（OH）2D3联合作用对人牙周膜成纤维细胞表达RANKL和OPG的影响［J］.口腔医学研究，2012，4（28）:316-317.

［3］ 张兰，孙琳琳，丁岩，等.葡萄糖对人牙周膜成纤维细胞OPG、RANKLmRNA表达的影响［J］.中国美容医学，2013，1（22）:71-72.

［4］ 陈良娇，兰泽栋，陈建明.重组人白介素-1α对人牙周膜成纤维细胞表达RANKL和OPG影响的荧光定量RT-PCR研究［J］.口腔医学研究，2010，26（2）:197-198.

［5］ 于鑫，王月秋，许海平.Toll样受体2和4在脂多糖诱导人牙周膜成纤维细胞表达细胞核因子-B受体活化因子配基中的作用［J］.华西口腔医学杂志，2012，3（30）:325-326.

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1671-8194（2015）13-0088-02