张廷青 博士

1 问题的提出

某新建奶牛场从澳大利亚辛辛苦苦引进2 588头育成牛，但两年过去后却始终有30头无法受孕，未孕率为1.2%，这是目前较为准确的统计数据。我曾工作过的飞鹤奶牛养殖公司以及提供技术服务的辉山乳业集团和长富乳业集团亦存在一定比例的育成牛总是配不上。辉山乳业集团大约为5%，长富乳业集团则是0.3%。管理比较好的华夏奶牛场在2008年进口的2 800头育成牛中，也有20余头反复配种仍难受孕，不孕率为0.7%。以上这些不孕育成牛的体况发育、发情周期和生殖系统解剖形态及分泌物均正常，但就是长期配种不受孕。理性分析，这种不孕很难归咎于饲养管理不当或繁殖技术员能力欠佳，因为同群中的绝大多数育成牛在同等条件下却无受孕困难，均可及时受孕。在2010年青岛中国奶牛发展大会，时任伊利牧业公司负责人的于飞曾当面问我:“为什么有些育成牛总是难以受孕?”我当时的回答是:“如果育成牛未孕率低于5%，这属于正常，是可以接受的;正如初婚少妇，大概总有低于5%者不能受孕，但迄今也难以阐述不孕机理。”坦率地说，这种回答只是陈述了客观事实，并未触及事物本质。我当时就对自己的答复感到难堪，自觉搪塞敷衍，十分不满意。两年以来，青岛尴尬应答一幕始终袭绕心头，久难释怀;加之征战各奶牛场繁殖技术员如实陈述并殷切期望给予科学合理解释，使我日感需尽早破解这一棘手难题。衷心感谢美国年轻女动物繁殖科学工作者McDaneld博士的出色工作，其研究结果至少部分解答了为什么育成牛中总有1%～5%配不上的原因，以下我们尝试理解其研究思路和初步发现。

2 发达国家的数据积累反映了什么?

限于篇幅，本文只列举美国和英国的统计数据。

1)美国

美国自1963年至2003年，40年来奶牛群奶量提高了3259公斤，但与此同时，自1960年至2000年，空怀日亦增加了16.5天。鉴于此，美国农业部的奶牛育种学家对2003年3月至2005年8月期间其家畜改良计划实验室的相关资料进行了分析。这些资料来自全美41个州的2 668个奶牛场，涉及362 512头育成牛的537 938次配种，系截至目前最大的奶牛育成牛繁殖资料样本，有一定说服力。表1概括了配种次数与情期受胎率的关系。需要说明的是，超过7次配种的育成牛资料被剔除，这些育成牛的总头数大概占全部配种数据的0.25%。

表1 配种次数与情期受胎率的关系

配种次数与情期受胎率的关系一目了然，无需赘述。有心的同道会问:为什么有些育成牛配种5次仍难受孕?

2)英国

5年前，英国在19家奶牛场对影响育成牛留养率和繁殖率的若干因素进行了分析和归纳，其中表2的某些结果与本文密切相关。

表2 自配种至首次分娩产奶，各阶段育成牛损失率及死亡原因总结

此表虽然提供了较多信息，以及如何提高奶牛群体整体繁殖效率各关键控制节点，但同道们只需注意用黑体编注的妊娠育成牛一栏。该栏清楚表明:育成牛的不孕率为3%。

简言之，上述英美两个国家的统计资料毫无悬念的证实:在发达国家，如同中国一样，依然有1%～5%的育成牛屡配不孕!那么，如何藉用现代高科技应对这一实实在在的挑战呢?

3 McDaneld博士是如何破解这一难题呢?

众所周知，繁殖性状的遗传力是非常低的，大约在0.04～0.16之间。因此，如欲在庞大总体中准确筛选出基因组区域具有低生育力遗传标记的个体，无疑大海捞针。加之，与繁殖效率相关的个体基因位点本身就非常微妙精细，如果采用一对一的办法进行逐一个体分析，即使有愚公移山的精神，旷日持久的努力亦难实现预期目标。鉴于此，McDaneld博士采用分组合并血样的办法解决，即将不同生育力组育成牛个体血样合并一起做相似个体同组分析。对生育力分组的定义如下:

A.生育力好:两年配种均妊娠。

B.生育力一般:两年配种仅有一年妊娠。

C.生育力差:两年配种均未妊娠。

McDaneld博士采集生育力差育成牛血样并合并提取DNA(脱氧核糖核酸)的工作概述如下。

1)采集生育力差育成牛血样并提取DNA。

这一工作主要是在肉牛品种完成，总共涉及7 078头肉母牛，表3是部分数据。

表3 各生育力组育成牛血样采集基本资料

2)应用单核苷酸多态性标记法(SNP Marker Assay)。

McDaneld博士的第二步工作是:应用超过700 000的单核苷酸多态性标记法(其中相当数量的单核苷酸多态性存在于Y染色体区域)对表3的各组代表性样品进行分析，尝试鉴别与影响繁殖效率相关的基因组变异区域。令人意外的是:从生育力差组获得的荧光强度介于正常母牛和公牛之间，这间接证实:生育力差组中至少某些育成牛个体的基因型很可能含有Y染色体区域的若干基因。进一步研究发现:Y染色体上的1 224个单核苷酸多态性，有550个存在于生育力差育成牛组的基因型内。同时，生育力好组和生育力一般组获得的荧光强度均在预期值范围内，说明这两组育成牛个体的基因型不可能含有Y染色体区域的若干基因。

3)应用实时定量PCR(Quantitative Real Time-PCR=QRT-PCR)技术。

McDaneld博士的第三步工作是:应用实时定量PCR技术确定生育力差育成牛组基因型内存在Y染色体的某些片段。表4共列出QRT-PCR的8对引物，其中GAPDH基因引物是用来监控样品DNA的质量和含量;Y_SNP_1、Y_SNP_2、Y_SNP_3、Y_SNP_4、Y_SNP_5和Y_SNP_6等6对引物则分别扩增Y染色体对应的单核苷酸多态性1、2、3、4、5和6。Bov_Y引物扩增产物以往可用来确定胚胎性别，此次研究中使用是为了确定生育力差育成牛组基因型内是否存在Y染色体片段。表4最后一列为扩增产物的碱基对数量。对总数319头2年配种未孕的育成牛DAN应用QRT-PCR扩增技术检测的结果是:含有Y染色体片段阳性者比率高达21%～29%!经验丰富并细心的读者会诘问:妊娠早期双胎中死亡的雄性胚胎会误导人们以为存活至足月分娩的雌性胚胎为正常母犊而非异性孪生母犊，McDaneld的检测结果是否确定出了分娩时未发见的异性孪生母犊?回答是否定的，因为大量统计数据显示:妊娠42日之前，双胎中死亡其中一个胚胎的发生率仅为6%。那么，究竟为什么两年配种未孕育成牛中有21%～29%个体携带Y染色体的部分片段呢?目前尚未破解其机理，人们只是推测在配子生成过程期间，性染色体单体相互交换时可能发生了Y染色体某些片段的错位或移位。

表4 QRT-PCR 8对引物的序列结构

图1清楚显示:12头2年配种未孕育成牛中至少有8头携带Y染色体部分片段(3、4、5、6、7、8、9和12);Bull=公牛DNA;Cow=母牛DNA。A图为应用Bov_Y引物扩增结果;B图为应用Y染色体单核苷酸多态性1引物扩增结果。两图中公牛均呈阳性，说明Y染色体基因组完整;但A图中的被检测育成牛阳性者在B图并未全部呈阳性，说明这些2年配种未孕的育成牛只是携带了Y染色体的部分片段。

图1 12头2年配种未孕育成牛应用Bov_Y引物(A图)和Y染色体单核苷酸多态性1引物(B图)扩增产物结果

4 McDaneld博士是否真的破解了奶牛育成牛中总有1%～5%难以受孕这一棘手难题呢?

图2 McDaneld博士

McDaneld博士(图2)的研究思路和设计无疑是独具匠心的，其研究结果的确对探索奶牛育成牛不孕症病因和指导临床防治工作提供了新的思路。肉牛育成牛生育力差的情形与奶牛育成牛有相似处，McDaneld博士的发见亦可用来推测生育力差的奶牛育成牛也极可能存在类似现象。不过，这仍需在奶牛方面开展这项研究，藉以获得真实证据。因此，从严肃认真的科学态度来说，目前我们还不能断然下结论:1%～5%奶牛育成牛难以受孕的棘手难题业已彻底破解。对现场工作者而言，读懂或完全理解本文需要具有最基本的分子遗传学基础知识。撰写本文初始，我已预感到同道们会感到困惑。也许，McDaneld博士发表其研究结果时采用如下的英文标题能使同道们记住本文的要旨:

“Y are you not pregnant:Identification of Y chromosome segments in female cattle with decreased reproductive efficiency.”翻译过来是:“为什么您未妊娠?确定生育力差育成牛携带Y染色体片段。”英文标题中的“Y”用得非常妙!“Y”的发音相似于“Why”，所以:“Y” =“Why(为什么)” =Y染色体，画龙点睛、一字数意，便于理解和记忆!

下期我们讨论为什么兽医繁殖人员应合二为一，实行幷岗?