张译捷，王智锋，陈文彬，李 杏，杨珍珍，杜玉涛

(深圳华大方舟生物技术有限公司，广东 深圳518083)

动物转基因技术是一种应用于实验生物学和应用生物学强有力的工具［1］。这种技术使得人们在生物体内直接研究基因相应的功能、调控作用，以及其在正常状态和疾病发生过程中的作用机制成为现实［2～4］。转基因技术构建的相关人类疾病的动物模型，使科学家能够清楚地认识相关疾病对应的遗传学和分子机制，从而能够开发出对应的疾病治疗方案以及设计出对应的药物靶点［5～8］。

原核显微注射法是目前应用最广泛的制备转基因小鼠技术，该方法操作较简单，容易得到完全整合的小鼠，并且得到的转基因动物大多数可以传代［9］，但是存在获得转基因小鼠效率较低的问题。外源DNA 浓度是影响转基因小鼠制备效率的主要因素之一［10］。因此原核显微注射中，选择最佳的外源DNA 浓度对科研、生产都非常重要。另外，小鼠品系也是影响转基因效率的因素之一［11］。在Anna B 文章中显示，采用C57/BL6 小鼠制备转基因小鼠效率较KM 小鼠低［11］。郑敏等报道，低浓度的外源DNA 注射液有利于提高转基因小鼠的制备效率，但只针对特定的DNA 长度［12］，且采用KM 小鼠为实验对象，实验数据不足以对C57/BL6小鼠提供参考。本实验采用C57/BL6 小鼠进行实验优化。

1 材料与方法

1.1 试剂、仪器与材料

试剂: 孕马血清促腺激素(PMSG)、人绒毛膜促性腺素(hCG) 购于宁波第二激素厂; 透明质酸酶、M2、M16 培养基、矿物油均购于Sigmar 公司;酶切产物的纯化试剂盒购于Omega 公司。

仪器与主要耗材: 体式显微镜、倒置显微镜购于Nikon 公司; 显微注射系统购于Eppendorf 公司;拉针仪、煅针仪分别购于Sutter 公司、Narishige 公司; 原核注射针、持卵针、胚胎移植针均为自制;培养皿及操作盘均购于Becton Dickinson 公司。

1.2 实验动物

供体鼠为4 ～6 周龄C57/BL6 小鼠; 结扎公鼠、受体母鼠皆为KM 小鼠，购于南方医科大学实验动物中心。

1.3 实验方法

1.3.1 外源DNA 的制备

将质粒DNA 扩增后，酶切线性化，用凝胶回收法纯化后融于无菌的TE 缓冲液中，稀释至相应浓度，置于-20 ℃保存等待注射。

1.3.2 供体鼠、结扎公鼠、受体鼠的制备

动物饲养室的光照时间调节为5: 00-19: 00，19: 00 至次日5: 00 为夜晚。

对4 ～6 周龄的C57/BL6 雌性小鼠注射10 IU PMSG，48 h 后注射10 IU hCG，与C57/BL6 雄性小鼠合笼交配，收集有阴道栓的小鼠; 对4 周龄以上的具有生殖功能的KM 雄性小鼠进行麻醉，通过外科手术将其输精管剪断，缝合后，静养4 周，与母鼠合笼制备受体母鼠; 选4 周龄以上的KM 雌性小鼠与结扎公鼠合笼，次日收集见栓的雌性小鼠，进行胚胎移植。

1.3.3 受精卵的收集及处理

对有阴道栓的C57/BL6 雌性小鼠人道处死，剖腹，取卵巢及部分子宫角。取出的组织用M2 清洗，放置在新的M2 溶液中，在体式显微镜下，用利器划开输卵管，使受精卵从输卵管中流出。用移液器将带颗粒细胞的受精卵转至1 mg/mL 透明质酸酶中消化去除颗粒细胞。在M2 操作液中清洗若干次后，挑选有2 个原核、形态良好的受精卵，转至M16 培养液放于37 ℃、5% CO2、5% O2、饱和湿度培养箱中待用。

1.3.4 显微注射

取20 ～30 枚受精卵于注射盘内，对较大原核(雄原核) 进行注射，见到原核体积明显增大原来1/3 才算成功注射。若受精卵原核无明显增大，说明外源DNA 注射液未注入原核中，此类注射为无效注射。注射完毕，将注射后存活的受精卵转至M16 培养液中，放置于37 ℃、5% CO2、5% O2、饱和湿度培养箱内30 ～60 min 后移植［13］。

1.3.5 胚胎移植

取同日见栓的受体鼠，麻醉后通过外科手术在腹部侧位取出卵巢，用镊子撕破卵巢浆膜，找到输卵管壶腹部，吸有25 枚左右注射后胚胎的移植针插入其中，将胚胎移植入输卵管内，后将卵巢、输卵管送回受体鼠体内，缝合［13］。

1.3.6 基因型分析

小鼠出生10 d 后，剪小鼠脚趾及鼠尾抽提基因组DNA，进行PCR 分析，鉴定转基因阳性小鼠。

2 结果

在9 个片段大小不同的实验组中，相同外源DNA 片段浓度为2.5 ng/μl 实验组在小鼠怀孕率、出生率、F0 小鼠阳性率上，结果普遍比5.0 ng/μl实验组高(见表1)，总效率均高于5.0 ng/μl 实验组(见图1)。从图1 中可看到，外源DNA 长度对制备转基因小鼠效率无线性相关性，浓度的变化影响转基因小鼠制备的效率。

排除了外源DNA 片段长度对转基因效率的影响，研究外源DNA 浓度变化对转基因效率的影响，2.5 ng/μl 实验组在小鼠怀孕率(55.2%∶39.8%)、出生率(10.8%∶7.13%)、阳性率(12.4%∶8.53%)、总 效 率(1.17% ∶0.54%) 等结果均显著高于5.0 ng/μl实验组(见表2)。2.5 ng/μl DNA 实验数据在怀孕率、出生率、阳性率、总效率比5.0 ng/μl DNA 注射液结果显著提高。

图1 不同DNA 片段大小的转基因小鼠制备效率

3 讨论

目前通过原核注射的方法制备转基因小鼠，仍是广泛应用的转基因技术。显微注射法可以直接对大分子DNA 片段进行操作，容许对转基因表达载体进行充分优化［10］。但影响显微注射法制备转基因小鼠效率的因素较多［14］，如小鼠品系、DNA 浓度、DNA 片段的状态及注射针等，因此对显微注射法制备转基因小鼠进行优化，仍有重要的意义。

表1 不同大小片段的DNA 显微注射结果

表2 两种浓度的DNA 显微注射结果

DNA 的浓度对转基因小鼠的研制效率有较大影响［15］。DNA 浓度过高，小鼠胚胎注射后的存活率较低，从而降低转基因小鼠的制备效率; DNA浓度过低，转基因小鼠的阳性率较低，甚至得不到转基因小鼠［10］。本实验采用C57/BL6 小鼠为实验对象，对原核期受精卵注射2.5 ng/μl DNA 溶液，怀孕率、出生率、阳性率、总效率均有显著的提高。参考Anna B 的分析，C57/BL6 小鼠虽是常用的转基因供体小鼠，但该品系获得的转基因小鼠效率较其他品系低［11］，可能原因是DNA 注射液对胚胎而言是外来物，对胚胎有轻微的毒性，C57/BL6小鼠胚胎对外源物质更为敏感。对C57/BL6 品系小鼠而言，2.5 ng/μl 的DNA 溶液更适合注射。该结果与郑敏等人的结果一致，但与外源DNA 长度无较大相关性。

本实验在对不同大小DNA 片段注射结果中发现，转基因小鼠制备效率与DNA 片段大小未呈现负相关，结果与池骏等人的结果不同［16］。DNA 片段长度并不是影响转基因小鼠制备效率的主要因素，在注射相同片段DNA 的结果中，浓度是影响转基因小鼠制备效率的主要因素。

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