蒋笑，侯大标，吴文锐，冯仕彪，查振刚(暨南大学附属第一医院骨关节科，广东广州510632)

不同年龄女性人群血液中的Dkk-1水平与骨密度相关性的分析研究*

蒋笑，侯大标，吴文锐，冯仕彪，查振刚△
(暨南大学附属第一医院骨关节科，广东广州510632)

目的:探讨不同年龄女性人群血液中的Dickkopf-1(Dkk-1)水平与骨密度之间的相关性。方法:选取2013年3月～2014年6月在我院行体检的100例年龄处于20～80岁之间的女性志愿者，按照不同年龄分为青年组(20～39岁)、中年组(40～59岁)和老年组(60～80岁)，从中年女性组中抽取45～55岁25人，分为绝经期女性组和未绝经女性组。采用酶联免疫吸附法测3组志愿者血清Dkk-1的表达水平，采用双能X线骨密度测量仪测定3组志愿者全身矿含量，分析不同年龄女性以及绝经与否女性血清Dkk-1水平的差异及Dkk-1水平与骨密度的关系。结果:随着年龄的增长，人群血清Dkk-1水平相应增高(P＜0.05)，骨密度相应降低(P＜0.05);3组志愿者中，血清Dkk-1水平与骨密度均呈负相关(P＜0.05)。45～55岁年龄范围内，绝经组女性血清Dkk-1与未绝经妇女相比，Dkk-1水平与骨密度降低的相关性更为密切(P＜0.05)。结论:人体随着年龄的增加，血清Dkk-1水平会上升，并出现骨密度下降，有发生骨质疏松症的风险。相同年龄范围妇女中，绝经后妇女Dkk-1水平表达较高，骨密度降低更明显，有更大的发生骨质疏松症危险。Dkk-1表达的增加同时可抑制骨形成和促进骨吸收，有望成为预防和治疗骨质疏松症治疗的一个新靶点。

年龄;女性;Dickkopf-1;骨密度

［ABSTRACT］AIM:To conduct the relevance analysis of serum Dickkopf-1(Dkk-1)and bone mineral density (BMD)in the different ages of female populations.METHODS:The women volunteers(n=100，20～80 years old) were selected and divided into young group(20～39 years old)，middle age group(40～59 years old)and elderly group (60～80 years old).The serum levels of Dkk-1 in the 3 groups of volunteerswere detected by ELISA.In themiddle age group，25 people of45～55 years old were selected and divided into postmenopausal group and premenopausal group to detect the serum levelof Dkk-1 in the2 groups of volunteers by ELISA.The BMD wasmeasured by themethod of dual energy X-ray absorptiometry.The differences of Dkk-1 expression levels among different ages of female populations，and the relevance with BMD were compared.RESULTS:With the increase in age，the serum Dkk-1 expression level increased(P＜0.05)，and BMD were reduced(P＜0.05).The blood levelof Dkk-1 and BMD negatively correlated(P＜0.05)in the 3 groups of volunteers.The serum levels of Dkk-1 and BMD had stronger negative correlation in postmenopausalwomen group than that in premenopausal women group.CONCLUSION:With the increase in age，the expression level of serum Dkk-1 increases and the BMD level decreases，which contribute to a risk of osteoporosis.In the same age range，the postmenopausal women express higher level of Dkk-1，and the decreased BMD ismore obvious，which contribute to a greater risk of osteoporosis.The increased level of Dkk-1 also inhibits bone formation and promotes bone resorption.Itmay become a new target for preventing and treating osteoporosis.

［KEY WORDS］Age;Female;Dickkopf-1;Bonemineral density

人体的骨代谢是一个包括成骨和破骨的动态平衡过程，随着年龄和雌激素的变化，会导致各种信号通路效能的增强或降低，从而使成骨细胞与破骨细胞的增殖分化紊乱，当成骨细胞增殖分化受到抑制而破骨细胞增强的时候，可能会出现骨代谢失衡。骨代谢失衡可导致人体骨密度(bonemineral density，BMD)减少和骨结构异常，进而表现骨质疏松和骨质破坏［1］。近年来，治疗骨质疏松症的分子靶向药物有了长足的发展。随着分子靶向药物的兴起，调控骨质平衡的各种通路的研究也不断深入。分泌型糖蛋白Wnt信号通路与骨形成关系密切，Dickkopf-1 (Dkk-1)是Wnt途径重要的调控分子，目前研究认为Dkk-1通过阻断Wnt信号向胞内传递，从而使骨形成减少［2］。同时有研究发现Dkk-1可促进破骨细胞分化因子的表达，从而增加破骨细胞数量和活性［3］。因此Dkk-1在人体骨代谢过程中起骨形成抑制作用和骨破坏促进作用。本研究主要通过分析不同年龄女性人群之间血清Dkk-1水平的差异，以及Dkk-1水平与骨密度的相关性，为Dkk-1单克隆抗体应用于治疗骨质疏松的临床试验提供理论基础。

材料和方法

1一般资料

选取2013年3月～2014年6月在我院行体检的女性志愿者100例，年龄20～80岁，平均年龄(54.58±6.39)岁，平均身高(1.61±0.04)m，平均体重(51.26±2.82)kg，平均体重指数为(27.13± 1.26)kg/m2。其中年龄20～39岁34人，设为青年组;年龄40～59岁35人，设为中年组;年龄大于60岁31人，设为老年组。所有患者均签署知情同意书，且本研究经我院医药伦理委员会审批通过;排除患有心、肝、肾及血液系统疾病者，伴有糖尿病或甲状腺功能亢进等影响骨代谢的慢性疾病者，体检前半年内曾使用过激素类或影响骨代谢的其它药物者。

2研究方法

Dkk-1及骨密度的水平的测定遵循双盲原则。所有志愿者均于体检当天清晨抽取空腹肘静脉血，并于2周后再次抽血，以1 000 r/min速率在4℃条件下离心5 min后分离并提取血清，分装于EP管后置于－80℃冰箱冻存待用，采用酶联免疫吸附法检测血清Dkk-1的浓度，Dkk-1试剂盒购自R＆D，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。采用双能X线骨密度测量仪(Hologic.)测量所有志愿者腰L2～4、股骨颈(neck)、股骨大转子(trochiter)和Ward’s三角区部位的BMD(g/cm2)，最终记录2次检测后的平均值。整个测量过程由计算机软件控制自行定位、测量、处理分析数据并打印数据，重复测定的变异系数为0.5%。

3统计学处理

所有数据经核对证实后均经SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组数据间比较采用单因素方差分析，采用Pearson相关分析方法分析血液Dkk-1水平与骨密度的相关性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1不同年龄女性人群各个部位BMD的差异

3组志愿者的BMD两两比较差异均有统计学意义(P＜0.01)，从数据可知，随着年龄的增长，人体各个部位BMD降低。中年组志愿者各个部位BMD明显较青年组志愿者降低，老年组志愿者各个部位BMD降低幅度进一步加大，见表1。

表1　不同年龄女性人群各个部位的BMDTable 1.The BMD of different regions of the body in young group，middle age group and elderly group(g/cm2.Mean±SD)

2不同年龄女性人群血清Dkk-1水平的差异

3组志愿者血清Dkk-1的表达两两比较均有统计学意义(P＜0.05)，以老年组表达最高，其次为中年组，最低为青年组，随着年龄的增长，人群血清Dkk-1水平相应增高，见表2。

表2　不同年龄女性人群血清Dkk-1水平Table 2.The serum Dkk-1 level in different ages ofwomen(ng/ L.Mean±SD)

3不同年龄女性人群血清Dkk-1水平与全身骨矿含量(total body bone m ineral content，TBBMC)的相关性

3组志愿者中，血清Dkk-1水平与TBBMC均呈负相关(P＜0.05)，见图1。

Figure 1.The correlation between serum Dkk-1 level and TBBMC in young group，middle age group and elderly group.图1　不同年龄女性人群血清Dkk-1水平与全身骨矿含量的相关性分析

4相同年龄范围内绝经和未绝经女性血清Dkk-1水平与TBBMC的相关性

从中年志愿者抽取的45～55岁(n=25)2组志愿者血清Dkk-1水平与TBBMC均呈负相关(P＜0.05)，见图2。

Figure 2.The correlation between serum Dkk-1 level and TBBMC in postmenopausal group and premenopausal group ofmiddle age.图2　中年组内绝经和未绝经人群血清Dkk-1水平与全身骨矿含量的相关性分析

讨论

正常人骨骼系统新陈代谢过程中，破骨细胞的骨吸收作用与成骨细胞的骨形成作用处于动态平衡，这两者的增殖分化又受到了各种因素如信号通路的调控。因各种因素，如年龄、激素导致信号通路的紊乱，出现破骨细胞的骨吸收作用大于成骨细胞的骨形成作用，则可导致骨量减少，骨密度下降，最终会发展成为骨质疏松症［4］。骨质疏松症可导致人体骨质脆性增加，可以导致疼痛，也会大大增加骨折风险，已有多项研究报道，约20%骨质疏松性骨患者骨折后死亡，而将近40%骨质疏松性骨折患者骨折后生活不能自理，严重影响患者生活质量［5］。

目前临床上应用于治疗骨质疏松的药物多种多样，但除辅助药物以外更多抑制破骨细胞活性，只有少数药物增强成骨细胞活性，例如激素类药物，国内已有学者初步证明雌激素可以同时作用于成骨与破骨细胞，使骨量增加，促进骨折的愈合，但其临床价值还需要进一步研究［6］。即便是作用于成骨细胞，其药物的靶点也不相同。随着骨重塑的分子生物学的不断发展，调控骨重建的多条信号转导通路被不断发现、研究，例如:调控破骨细胞的信号转导通路有RANKL/RANK信号通路、整合素(integrin)αv、β3信号通路等;调控成骨细胞的信号转导通路有Wnt/β-catenin信号通路、钙敏感受体(Ca2+-sensing receptor，CaSR)信号通路、骨形态发生蛋白(bonemorphogenic protein，BMP)信号通路等。随着信号通路认识的不断深入，很多专家根据这些信号转导通路研发了多种新的治疗骨质疏松症的靶向药物。分子靶向药物通过信号靶向机制增强成骨细胞的增殖分化，既保证成骨细胞活性也增加成骨细胞的数量，即“保质保量”，所以这类药物有较大的发掘潜力。值得一提的是，促进成骨细胞功能药物在抗骨质疏松的同时也能促进骨质疏松并发骨折的愈合［7］。

在调控成骨细胞增殖、分化的信号通路中，研究得较为透彻的是Wnt信号通路，Wnt信号通路在成骨细胞的发育、分化及骨形成作用中起关键作用［8］，Dkk-1对Wnt信号通路起负向调控作用［9］。Dkk-1是一种分泌性糖蛋白，可通过与低密度脂蛋白受体5/6(Lrp5/6)和另一类穿膜蛋白Kremen1/2结合形成三聚体，使得细胞外Wnt配体不能与Lrp5/6结合，从而抑制与骨形成相关的Wnt信号转录，进而阻断成骨细胞的分化及骨形成作用，使骨形成减少［10］。

有研究发现，Dkk-1可增加巨噬细胞集落刺激因子等促进破骨细胞分化因子的表达，进而增加破骨细胞数量和活性，促进骨吸收作用，因此Dkk-1表达的增加不仅可抑制成骨细胞的骨形成作用，还可促进破骨细胞的骨吸收作用［11］。已有多项动物模型试验证实Dkk-1是BMD的调控因子之一［12］。章瑜等［13］通过建立Dkk-1沉默的小鼠U266细胞，研究得出，U266细胞中Dkk-1基因沉默后，其培养上清抑制小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化的能力减弱。从另一个角度证实了Dkk-1对于干细胞向成骨细胞分化的抑制作用。Dkk-1的发现为骨质疏松症的治疗提供新思路，通过制备相关Dkk-1抗体干扰Dkk-1的表达，提高Wnt信号通路的活性，进而促进成骨细胞的骨形成作用从而增加BMD［14］。Dkk-1有望成为骨质疏松治疗的一个靶点［15］。大量临床和基础实验研究得出结论，年龄的增长对骨密度产生影响［16］，本研究结果也显示，随着年龄的增长，女性群体血清Dkk-1的表达水平升高，而骨密度降低，尤其是老年人群BMD降低更明显。同时本研究发现，不同年龄女性人群中血清Dkk-1水平与骨密度呈负相关，且年龄越大，两者相关性越强，表明年龄和血清Dkk-1水平均是骨密度的影响因素。随着女性群体年龄的增长，尤其是绝经后(一般认为女性绝经时间在45～55岁)，雌激素降低导致骨质保护作用减弱、饮食及活动减少等各方面原因会导致骨密度降低［17］。之前有许多学者通过男性、女性的多角度，对于年龄、Dkk-1和骨密度的关系的研究证实了Dkk-1是导致骨密度下降的重要分子因素［18］。本研究结果不仅提示了年龄与Dkk-1高表达密切相关且导致骨密度降低(相同BMD水平，老年组人群血清Dkk-1水平较中年组和青年组高，提示老年女性人群是骨质疏松症高危人群)。此外，在相同年龄组(中年组)中，在尽量排除年龄因素后(45～55岁)，未绝经女性Dkk-1表达水平较低，骨密度下降相对缓慢。绝经女性DKK1表达较高，且骨密度下降相对剧烈，即Dkk-1与骨密度下降的相关性更加密切。这也证实了绝经对于女性骨量起到了加剧丢失的作用。因此，对于中老年人，尤其是绝经后高龄妇女，应注意骨质疏松症的防治，采取各种适合自身的干预措施以减少骨质的吸收和增加骨形成，从而减少或延缓骨质疏松的发生。但目前用于治疗骨质疏松症的Dkk-1抗体的临床试验尚未开展。本研究主要在临床层面分析Dkk-1与骨质疏松症的相关性，确定Dkk-1为骨质疏松治疗的新靶点地位，通过应用Dkk-1单克隆抗体阻断Dkk-1的表达可能成为骨质疏松症的治疗方法。必须指出的是，Dkk-1抗体仍然要解决特异性的问题，其对骨骼外其它器官的毒副作用是今后研究的关键［19］。

综上所述，人群骨密度受年龄、激素等影响，有可能会导致信号通路的紊乱，如Dkk-1高表达会对Wnt信号造成负向调控。而血清中Dkk-1水平与骨密度呈负相关，这种联系为骨质疏松症的预防、诊断和治疗提供了新思路，即可通过抑制Dkk-1的表达，促进骨形成，减缓骨量的丢失，这也有望成为骨质疏松治疗的一个新靶点。

人体骨骼发育在达到一定的峰值后，骨密度下降是不可避免的，本研究固然是想通过信号通路的靶点，为分子靶向药物治疗骨质疏松症奠定理论基础，但也同样着眼于骨密度下降和骨质疏松症的预防。对骨质疏松症研究的目的，不仅仅是为了在严重骨质疏松症的情形下采取被动的应对措施，我们更应该用发展的观点，将其作为骨密度变化的连续过程来看待。如果在骨密度下降早、中期就能找到相关的调控点，那么对于骨质疏松症的防治也能起到一定的作用。所以，下一步的研究主要是加大研究人群数量和范围(尤其是绝经期妇女)，以便进一步了解Dkk-1水平能否作为一个敏感的诊断指标，并通过这个指标，能够早期预防骨密度的下降，并最终延缓骨质疏松症的发生和发展。

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Relevance analysis of serum Dkk-1 expression and bonem ineral density in different ages of female populations

JIANG Xiao，HOU Da-biao，WUWen-rui，FENG Shi-biao，ZHA Zhen-gang
(Department of Orthopaedics，First Affiliated Hospital of Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail:263784833 @qq.com)

R392.12

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.024

1000-4718(2015)05-0906-05

2015-01-15［修回日期］2015-04-28

国家自然科学基金资助项目(No.81472089)

Tel:020-38688563;E-mail:zhzgg@vip.163.com