申燕，肖嫣，王丽君，赵艳，田雨灵，梁潇，尹爱萍(西安交通大学医学院第一附属医院肾病中心肾内科，心内科，西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室，陕西西安7006)

吡格列酮对尿毒症ApoE－/－小鼠调节性和效应T细胞平衡的影响*

申燕1△，肖嫣2，王丽君3，赵艳2，田雨灵2，梁潇2，尹爱萍1
(西安交通大学医学院第一附属医院1肾病中心肾内科，2心内科，
3西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室，陕西西安710061)

目的:观察吡格列酮对体外培养的有或无斑块特异性抗原氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激的尿毒症ApoE－/－小鼠调节性和效应T细胞(Treg/Teff)水平和功能相关因子的影响及可能机制。方法:通过两步外科手术法建立尿毒症ApoE－/－小鼠的动物模型，以不同浓度吡格列酮(2μmol/L和20μmol/L)及PPARγ拮抗剂GW9662(5μmol/L)对有或无oxLDL(2 mg/L)刺激的尿毒症模型鼠脾细胞作用12 h后，流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+Treg及IFN-γ+CD4+Teff细胞水平，实时荧光定量PCR检测Foxp3及IFNγ的mRNA表达。结果: oxLDL体外诱导尿毒症ApoE－/－小鼠脾细胞Treg/Teff失衡。吡格列酮上调oxLDL抑制下的Treg及Foxp3的表达，此作用不能被GW9662拮抗;下调有或无oxLDL刺激下Teff及IFNγ的表达，此作用可被GW9662拮抗。结论:ox-LDL体外诱导尿毒症模型鼠Treg/Teff失衡，吡格列酮通过PPARγ非依赖/依赖机制调整Treg/Teff失衡。

吡格列酮;过氧化物酶体增殖物激活受体γ;尿毒症;调节性T细胞;效应T细胞

［ABSTRACT］AIM:To investigate the effects of pioglitazone on the quantity and function-related factors of regulatory and effector T cells(Treg and Teff)of uremic apolipoprotein E knockoutmice in vitro with orwithout the stimulation of atherosclerotic plaque-specific antigen oxidized low-density lipoprotein(oxLDL).METHODS:Uremic apolipoprotein E knockoutmouse model was established by 2-step surgical procedure.After intervention with different concentrations(2 μmol/L and 20μmol/L)of pioglitazone and PPARγantagonistGW9662(5μmol/L)on splenocytes ofuremicmice for12 h in the presence or absence of oxLDL(2mg/L)，the levels of CD4+CD25+Foxp3+Treg and IFNγ+CD4+Teffwere determined by flow cytometry.ThemRNA expressions of Foxp3 and IFNγwas detected by real-time fluorescent quantitative PCR.RESULTS:In vitro，oxLDL induced a Treg/Teff imbalance in splenocytes from the uremic mice.Pioglitazone upregulated the level of Treg and mRNA expression of Foxp3 in the presence of oxLDL，which was not antagonized by GW9662.Meanwhile，pioglitazone downregulated the level of Teff and mRNA expression of IFNγin the presence or absence of oxLDL，which was reversed by GW9662.CONCLUSION:oxLDL induces a Treg/Teff imbalance in uremic apolipoprotein E knockoutmice.Pioglitazone modulates the Treg/Teff imbalance probably through PPARγ-independent and -dependentmechanisms.

［KEY WORDS］Pioglitazone;Peroxisome proliferator-activated receptorγ;Uremia;Regulatory T cells;Effector T cells

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是终末期肾病患者最常见的心血管并发症之一，且其病变进展快、范围广，已成为影响终末期肾病患者预后的重要因素［1］。但迄今为止，其发病机制仍不十分清楚，传统的抗AS治疗药物效果不佳。多数学者认为AS是血管壁的慢性炎症反应，T细胞亚群的活化和状态是其中的关键环节［2］。最近的研究表明效应T细胞(effector T cells，Teff)促进AS发展，而调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)则可抑制Teff而减缓AS进程［3］。有研究发现Treg/Teff平衡失调是终末期肾病患者AS发生发展的可能机制［4］。改善Treg/Teff失衡有可能成为延缓终末期肾病患者AS进展的新的治疗靶点。我们最近的研究表明过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)的配体吡格列酮(pioglitazone，PIO)可减轻尿毒症载脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E knockout，ApoE－/－)小鼠AS的进展并使斑块的稳定性增加［5］。因此本研究通过建立尿毒症ApoE－/－小鼠模型，观察氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，oxLDL)对模型鼠脾细胞Treg/Teff平衡的影响及PIO可否调控Treg/Teff平衡及可能机制，为PIO延缓终末期肾病、加速AS进展的机制提供理论依据。

材料和方法

1实验动物、主要试剂和仪器

C57BL/6J遗传背景的ApoE－/－种鼠(B6.129P2-ApoEtm1Unc)购自中国南京大学模式动物遗传研究中心，饲养于西安交通大学医学院动物实验中心层流室，出生后4周离乳，喂以标准饲料:5%脂肪、18.9%蛋白质、72.3%碳水化合物、1.01%钙及0.65%磷。

盐酸吡格列酮原药由江苏恒瑞医药有限公司馈赠;GW9662购自ALEXIS;oxLDL购自中山医科大学生物化学实验室;佛波酯、monensin、ionomycin和伴刀豆球蛋白A(concanavalin A，ConA)购自Sigma; RNAfast200总RNA极速抽取试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司;逆转录试剂盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas;SYBR®Premix Ex TaqTMRT-PCR Kit购自TaKaRa;PE标记抗小鼠干扰素γ(interferonγ，IFNγ)单克隆抗体和小鼠调节性T细胞流式细胞仪检测试剂盒购自eBioscience。

FACScan流式细胞仪(BD)由西安交通大学医学

院中心实验室提供;IQ5实时定量PCR仪(Bio-Rad)由西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室提供;Hitachi706全自动生化分析仪由西安交通大学医学院第一附属医院检验科提供;932型电烧灼器由西安交通大学医学院机能中心提供。

2方法

2.1尿毒症ApoE－/－小鼠动物模型的建立取8周龄雄性ApoE－/－小鼠，参照Nikolov等［6］的方法，采用2步外科手术法建立尿毒症模型:10%水合氯醛腹腔内麻醉后行2 cm侧腹切口，暴露右肾，仔细处理输尿管及避免损伤肾上腺，电凝整个皮质除了肾门周围2 mm完整组织，缝合肌层和皮肤;2周后，通过相似切口暴露左肾，在双结扎肾血管及输尿管后左肾被摘除，缝合肌层和皮肤。对照组行假手术:双肾被膜剥离(8周暴露右肾，10周暴露左肾)。第2次手术后2周，尿毒症和对照组ApoE－/－小鼠各8只采集血标本检测血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)、总胆固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)。

2.2分离尿毒症ApoE－/－小鼠脾细胞16周龄尿毒症模型鼠脱颈处死，75%乙醇浸泡5～10 min;左腹部朝上，剪开皮肤并分离筋膜，剪开肌肉层，暴露并分离脾脏;RPMI-1640培养液冲洗脾脏，剔除筋膜组织，转移至200目钢滤网，用玻璃针芯充分研磨; RPMI-1640培养液冲洗脾细胞至无菌培养皿中，收集脾细胞悬液，用红细胞裂解液混匀静置5 min，1 500 r/min离心7 min，弃上清;RPMI-1640培养液洗涤，1 500 r/min离心7 min，弃上清;重悬并调整细胞密度为2.2×109/L。

2.3实验分组及干预脾细胞悬液接种于6孔板，每孔1～1.5 mL，以含有PIO(或DMSO)的RPMI-1640培养液稀释1倍，分别加入ConA(5 mg/L)、10%胎牛血清，按分组加或不加oxLDL和GW9662 (5μmol/L)。oxLDL干预浓度依据参考文献［7］，以0、1、2、3及5 mg/L进行预实验，结果与文献一致，CD4+CD25+T细胞呈剂量依赖性下降，故以浓度2 mg/L作为本次实验干预浓度。

2.4流式细胞仪检测CD4+IFNγ+Teff数目细胞孵育8 h后分别加入ionomycin(1 mg/L)、monensin (1.7 mg/L)和佛波酯(25μg/L)，继续孵育4 h;收集细胞于EP管后1 500 r/min，4℃离心7 min，弃上清;流式缓冲液洗涤后重悬，加入含FITC-CD4或FITC-IgG2b的流式缓冲液100μL，4℃避光孵育30 min;洗涤后加入固定/破膜工作液0.8 mL，4℃避光孵育45 min;1 500 r/min离心7 min，弃上清;缓冲液洗涤后加入PE-IFNγ抗体1μL，对照管加入PE-IgG1抗体1μL，4℃避光孵育30 min;洗涤后重悬至500 μL，流式细胞仪检测。

2.5流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+Treg数目收集细胞于EP管后1 500 r/min，4℃离心7 min后洗涤;重悬后加入含FITC-CD4抗体、PE-CD25抗体的流式缓冲液100μL，4℃避光孵育30 min;洗涤后加入固定/破膜工作液0.8 mL，4℃避光孵育90 min;1 500 r/min，离心7 min后洗涤;细胞重悬后加入APC-Foxp3抗体或APC-IgG2b 2μL，4℃避光孵育30 min;洗涤后重悬至500μL，流式细胞仪检测。

2.6实时荧光定量PCR检测尿毒症ApoE－/－小鼠脾细胞IFNγ和Foxp3 mRNA的表达依据RNA fast 200试剂盒说明书提取总RNA;参照Fermentas逆转录试剂盒说明书合成cDNA;TaKaRa PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR，扩增反应条件如下:95℃10 s;95℃5 s，58.5℃10 s，72℃10 s，40个循环。每个样本均做3孔，GAPDH作为内参照。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。IFNγ的上游引物为5’-ATTACTACCTTCTTCAGCAACAG-3’，下游引物为5’-CGAATCAGCAGCGACTCC-3’;Foxp3的上游引物为5’-CCCAGGAAAGACAGCAACCTT-3’，下游引物为5’-TTCTCACAACCAGGCCATTTG-3’;GAPDH的上游引物为5’-TCAACGGCACAGTCAAGG-3’，下游引物为5’-ACTCCACGACATACTCAGC-3’。分析mRNA的相对表达量用2－ΔΔCt方法［8］。

3统计学处理

使用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。两样本参数检验用t检验。多个样本参数检验采用单因素方差分析(one-way ANOVA)方法，方差齐性用LSD检验，方差不齐用Dunnett’s C检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1成功建立尿毒症ApoE－/－小鼠模型

造模后2周，尿毒症ApoE－/－小鼠的尿素氮、肌酐较对照组明显升高(P＜0.05)，提示造模成功。尿毒症ApoE－/－小鼠与对照ApoE－/－小鼠相比，血清总胆固醇升高(P＜0.05)，甘油三酯的差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1　对照与尿毒症ApoE－/－小鼠肾功能和血脂的比较Table 1.Comparison of renal functional parameters and serum lipids between control and uremic ApoE－/－mice(Mean±SD.n=8)

2PIO对尿毒症模型鼠Teff水平的影响

以CD4+T细胞设门，将IFNγ+CD4+细胞在CD4+T细胞中的百分比视为Teff的水平。与溶剂对照组比较，2μmol/L和20μmol/L PIO均降低模型鼠脾细胞中Teff水平(P＜0.05)。在oxLDL作用下，模型鼠脾细胞中Teff水平明显升高(P＜0.05)，2 μmol/L和20μmol/L PIO降低oxLDL刺激下Teff水平(P＜0.05)，PPARγ拮抗剂GW9662可逆转PIO的作用(P＜0.05)，见图1。

3PIO对尿毒症模型鼠脾细胞IFNγm RNA表达的影响

oxLDL上调尿毒症模型鼠脾细胞IFNγ的mRNA表达(P＜0.05)。2μmol/L和20μmol/L PIO降低模型鼠及oxLDL刺激的模型鼠脾细胞IFNγ的mRNA表达(P＜0.01)，GW9662可逆转PIO的效应(P＜0.01)，见图2。

4PIO对尿毒症模型鼠Treg水平的影响

以CD4+T细胞设门，将CD4+CD25+Foxp3+细胞在CD4+T细胞中的百分比作为Treg的水平。PIO对模型鼠脾细胞Treg水平影响不显著(P＞0.05)。在oxLDL作用下，Treg水平降低(P＜0.05)，2μmol/ L和20μmol/L PIO分别增加oxLDL抑制下的Treg水平(P＜0.01)，GW9662不能拮抗PIO的作用(P＞0.05)，见图3。

5PIO对尿毒症模型鼠脾细胞Foxp3 m RNA表达的影响

oxLDL下调尿毒症模型鼠脾细胞Foxp3 mRNA的表达(P＜0.05)。PIO对模型鼠脾细胞Foxp3的mRNA表达无明显影响(P＞0.05)，但可上调oxLDL作用下的模型鼠脾细胞Foxp3 mRNA的表达(P＜0.05)，且这一作用不被GW9662所拮抗(P＞0.05)，见图4。

Figure 1.The effect of PIO on Teff level in the splenocytes of uremic ApoE－/－mice and the antagonism of GW9662 in vitro.Mean± SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs controlgroup;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs oxLDL group;#P＜0.05 vs PIO 2μmol/L group;▽P＜0.05 vs PIO 20μmol/L group;$P＜0.05 vs PIO 2μmol/L+oxLDL group;▲▲P＜0.01 vs PIO 20μmol/L+ oxLDL group.图1　PIO对尿毒症ApoE－/－小鼠脾细胞Teff水平的影响及GW 9662的拮抗作用

讨论

心血管疾病是慢性肾功能不全特别是尿毒症患者最常见的死亡原因，AS是引起心血管并发症的主要原因，并且进展更加迅速和严重。针对慢性肾衰患者高发的AS疾病，Lindner等［9］提出了“加速的AS”这一概念。我们前期的研究发现噻唑烷二酮(thiazolidinediones，TZD)类PPARγ配体PIO能延缓尿毒症ApoE－/－小鼠主动脉加速发展的AS并使斑块的稳定性增加，与上调尿毒症模型鼠体内Treg数量和功能有关［5］。为了进一步探索PIO对尿毒症状态下Treg/Teff平衡的影响及可能机制，我们进行了此项体外实验。

Figure 2.The effect of PIO on themRNA expression of IFNγin the splenocytes of uremic ApoE－/－mice and the antagonism of GW9662 in vitro.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;△△P＜0.01 vs oxLDL group;##P＜0.01 vs PIO 2μmol/L group;▽▽P＜0.01 vs PIO 20μmol/L group;$$P＜0.01 vs PIO 2μmol/L+oxLDL group;▲▲P＜0.01 vs PIO 20 μmol/L+oxLDL.图2　PIO对尿毒症ApoE－/－小鼠脾细胞IFNγmRNA表达的影响及GW 9662的拮抗作用

Figure 3.The effectof PIO on the Treg level in the splenocytes of uremic ApoE－/－mice and the antagonism of GW9662 in vitro.Mean ±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;△△P＜0.01 vs oxLDL group.图3　PIO对尿毒症ApoE－/－小鼠脾细胞Treg水平的影响及GW 9662的拮抗作用

目前已经公认AS病变实质上是一种慢性炎症反应或自身免疫性疾病，T淋巴细胞在其中发挥关键性作用［2］。CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞，具有抗炎和维持对自身抗原免疫耐受的作用，阻断不同的免疫炎症性疾病和抑制AS的进展［10］。Foxp3是Treg特异性的标志和发挥功能的关键因子［11］。效应性T细胞主要包括Th1、Th2和新近发现的Th17，通过促进免疫激活的不同方面而促进AS的进展［2］。病理性效应性T细胞主要通过分泌功能性细胞因子IFNγ加重AS局部的免疫炎症反应。Treg可抑制Teff的致病免疫反应，抑制AS的形成发展。最近的证据表明Treg与致病性Teff的失衡促进免疫介导的AS进展和斑块的不稳定［12-13］。在急性冠脉综合症患者中Treg数目减少、功能受损［14］。在动物模型中，获得性转移天然或抗原特异性的Treg缓解AS病变［7］。本研究发现oxLDL体外诱导尿毒症ApoE－/－小鼠脾细胞Teff水平及其功能因子IFNγ表达上调，致Treg水平及其核转录因子Foxp3表达下降，即Treg/Teff平衡失调。有报道在终末期肾病患者中oxLDL诱导的氧化应激使Treg对Fas介导凋亡的敏感性提高，线粒体依赖凋亡途径发生［15］。慢性肾衰体内存在氧化应激反应的增强［16］。因此结合我们的研究结果可以得出结论:尿毒症状态下提高的氧化应激使oxLDL产生增加，促进Treg凋亡，阻断Treg信号传导，导致外周Treg池的耗竭和Treg/Teff失衡。Treg数量功能的受损引起Teff功能增强，导致细胞免疫功能异常，促进尿毒症模型鼠AS的进展。

Figure 4.The effectof PIO on themRNA expression of Foxp3 in the splenocytes of uremic ApoE－/－mice and the antagonism of GW9662 in vitro.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs oxLDL group.图4　PIO对尿毒症ApoE－/－小鼠脾细胞Foxp3 m RNA表达的影响及GW 9662的拮抗作用

如何调正Treg/Teff失衡成为预防和治疗尿毒症“加速AS”的关键所在。人AS斑块处有PPARγ表达，提示PPARγ参与AS的病理过程。PPARγPIO属于TZD类药物，是PPARγ的药理性配基。临床试验证实PIO治疗可减轻2型糖尿病患者颈动脉AS病变［17］。本研究发现PIO抑制尿毒症模型鼠脾细胞Teff水平及其功能性细胞因子IFNγ的表达，此作用可被PPARγ拮抗剂GW9662所逆转，提示PIO通过PPARγ依赖途径下调Teff水平和功能。本研究还发现PIO上调oxLDL抑制的尿毒症模型鼠脾细胞Treg水平及其核转录因子Foxp3的表达，此作用不能被GW9662所逆转，提示PIO通过非PPARγ依赖途径上调Treg水平和功能。因此结合前期的研究，我们认为PIO通过PPARγ非依赖机制促进Treg的极化、PPARγ依赖机制抑制Teff的偏倚，调正Treg/Teff的失衡。PIO诱导尿毒症模型鼠T细胞谱向抗AS方向转化(更多的Treg及更少的Teff)，提高的Treg数量活性导致减少的Teff细胞介导的致病反应，从而发挥延缓AS斑块的进展和稳定斑块的作用。

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Effect of pioglitazone on balance of regulatory and effector T cells of urem ic apolipoprotein E knockoutm ice in vitro

SHEN Yan1，XIAO Yan2，WANG Li-jun3，ZHAO Yan2，TIAN Yu-ling2，LIANG Xiao2，YIN Ai-ping1
(1Department of Nephrology，Center of Nephrology，2Department of Cardiovascular Medicine，The First Affiliated Hospital，Medical School of Xi，an Jiaotong University，Xi’an 710061，China;3 Key Laboratory of Ministry of Education for Environment and Genes Related to Diseases，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China.E-mail:shenyan66@126.com)

R363;R692

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.006

1000-4718(2015)05-0802-06

2015-01-26［修回日期］2015-03-17

国家自然科学基金资助项目(No.81200541);中央高校基本科研业务费专项资金(No.xjj2012065)

Tel:029-85323952;E-mail:shenyan66@126.com