王竞男，杨立群，邓宇斌△(中山大学附属第一医院转化医学中心，广东广州50080;中山大学化学与化学工程学院高分子研究所，广东广州5075)

灯盏花素对人视网膜色素上皮细胞和糖尿病大鼠视网膜VEGF表达的影响*

王竞男1，杨立群2，邓宇斌1△
(1中山大学附属第一医院转化医学中心，广东广州510080;2中山大学化学与化学工程学院高分子研究所，广东广州510275)

目的:观察灯盏花素对高糖环境下人视网膜色素上皮细胞株ARPE-19中VEGF、VEGFR2和p-ERK蛋白的表达及对2型糖尿病大鼠视网膜VEGF表达的影响。方法:培养ARPE-19细胞，分为对照组、灯盏花素组、高糖组和高糖+灯盏花素组，ELISA检测VEGF的分泌水平，Western blot检测细胞VEGF、VEGFR2和p-ERK的蛋白水平;取正常大鼠，随机分为正常对照组、灯盏花素组、糖尿病模型组和糖尿病灯盏花素治疗组，16周后取各组大鼠眼球，观察大鼠视网膜的病理变化并评分，免疫组化观察VEGF的表达情况。结果:(1)细胞实验结果显示，灯盏花素组VEGF、VEGFR2和p-ERK的蛋白水平与正常对照组比较均减低(P＜0.05);高糖组细胞上述蛋白水平与正常对照组比较均增加(P＜0.05);高糖+灯盏花素组上述蛋白水平与高糖组比较表达均减少(P＜0.05); (2)大鼠视网膜病理学评分显示糖尿病组与正常对照组、糖尿病灯盏花素治疗组相比差异显著，灯盏花素组与正常对照组相比差异无统计学意义。糖尿病大鼠与正常对照组、灯盏花素组相比，视网膜VEGF的表达增加;糖尿病灯盏花素治疗组中VEGF的表达较糖尿病组有所降低(P＜0.05)。结论:灯盏花素可以降低ARPE-19细胞VEGF、VEGFR2和p-ERK的蛋白表达水平，抑制糖尿病大鼠视网膜VEGF的表达，提示灯盏花素可能通过降低糖尿病大鼠视网膜细胞和组织中VEGF的表达，缓解其糖尿病视网膜病变进程。

灯盏花素;糖尿病视网膜病;血管内皮生长因子

［ABSTRACT］AIM:To evaluate the influence of scutellarin on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF)in high glucose-treated human retinal pigmentepithelial cell line ARPE-19 and to observe the effects of scutellarin on the protein expression of VEGF，p-ERK and VEGFR2 in the retinas of type II diabetic rats.METHODS:Cultured ARPE-19 cells were divided into normal control group，scutellarin group，high glucose group and high glucose+scutellarin group.The protein levels of VEGF，p-ERK and VEGFR2 weremeasured by Western blot.The VEGF release in ARPE-19 cells was detected by ELISA.Normal ratswere randomly divided into normal control group and scutellarin group.Diabetic ratmodelwas established by feeding with high-fat diet and injecting with streptozocin，and randomly divided into diabetes group and diabetes treated with scutellarin group.After 16 weeks，the eyes were removed.The morphological changes of the retinas were observed under lightmicroscope with HE staining，and histopathological score was recorded.The expression of VEGF in the retinaswas observed by themethod of immunohistochemistry.RESULTS:Compared with normal control group，the protein levels of VEGF，p-ERK and VEGFR2 in the ARPE-19 cells decreased in scutellarin group，but increased in high glucose group.The histopathological score of the retinas showed significant difference among diabetes group，diabetes treated with scutellarin group and normal control group，and no significant difference between normal control group and scutellarin group was observed.The expression of VEGF increased in diabetic group and was significantly higher than that in scutellarin treatmentgroup(P＜0.05).CONCLUSION:Scutellarin inhibits the increased protein levels of VEGF，p-ERK and VEGFR2 in ARPE-19 cells，and decreases the expression of VEGF in the retinas of diabetic rats.The suppression of the diabetic retinopathy development by scutellarin may be partly involved in the ERK/MAPK pathway.

［KEY WORDS］Scutellarin;Diabetic retinopathy;Vascular endothelial growth factors

糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy，DR)是糖尿病引起的最严重的眼部并发症，致盲性高［1-2］。多种病理机制参与DR的形成，其中以血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)为主的促血管生长因子在视网膜中过度表达是导致DR发生、发展的重要因素。糖尿病病理过程中的高糖和缺氧可以诱导视网膜中的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞异常分泌VEGF，导致视网膜血管内皮细胞损伤，血管渗透性增加，毛细血管闭塞，从而促进视网膜的缺血和新生血管的形成［3-4］。此外，异常分泌的VEGF与其受体(主要是VEGFR2受体)结合后，激活MAPK/ERK信号通路，参与调节血管新生，导致新生血管形成增加，这也被认为是DR发病过程中的重要因素之一［5］。

灯盏花素(scutellarin)是从菊科属植物短亭飞蓬全草灯盏细辛中提取的一类黄酮类成分，主要分为灯盏乙素(scutellarin-7-O-glucuronide)和灯盏甲素(apigenin-7-O-glucuronide)(分子结构式见图1)，具有降低血液黏度、扩张血管、改善微循环以及抗氧化作用，目前已广泛应用于心脑血管疾病和肾脏病变等疾病的治疗［6-8］。Luo等［9］在2008年发现灯盏花素可以通过NF-κB通路抑制血管内皮细胞的炎症; Chen等［10］在2006年发现灯盏花素可以通过抑制fractalkine来缓解缺氧性肺动脉高压的发展，但其对VEGF、p-ERK和VEGFR2在RPE细胞上表达的影响还没有报道。

Figure 1.Molecular structure of scutellarin.A:scutellarin-7-O-glucuronide;B:apigenin-7-O-glucuronide.图1　灯盏花素的分子结构式

在本研究中，我们首先检测了灯盏花素在高糖环境下对RPE细胞株ARPE-19中VEGF、p-ERK和VEGFR2蛋白水平的影响，然后通过灯盏花素治疗2型糖尿病模型大鼠，进一步探讨其在治疗DR过程中的机制。

材料和方法

1实验动物和材料

SPF级健康雄性SD大鼠，体质量200～250 g，由中山大学实验动物中心生产供应部提供，合格证号为SYXK(粤)2011-0029。

DMEM培养基和胎牛血清(Gibco);VEGF抗体(Abcam);ERK、p-ERK、小鼠抗兔IgG和GAPDH抗体(Cell Signaling);BCA蛋白定量试剂盒(碧云天); VEGF ELISA试剂盒(R＆D);免疫组化试剂盒(中衫金桥);链脲菌素(streptozotcin，STZ)购自Sigma;注射用灯盏花素购自四川杰象药物有限公司。

2方法

2.1细胞培养及分组人视网膜上皮色素细胞ARPE-19细胞株从ATCC购得。培养液为含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105U/L链霉素的低糖DMEM培养液。细胞置于5%CO2、37℃培养箱中培养。ARPE-19细胞分为正常对照组、灯盏花素(5μmol/L)组、高糖(25.0 mmol/L葡萄糖)组和高糖+灯盏花素组，作用48 h后，收集细胞提取蛋白，收集上清，按照VEGF ELISA试剂盒的说明进行操作，最后在450 nm处检测吸光度(A)值。

2.2实验动物造模、分组和取材SD大鼠购进，适应环境1周后，喂以高脂饮食，其中碳水化合物45%，蛋白质15%，脂肪40%。高脂饮食喂养2个月后，随机取20只大鼠，空腹12 h，以0.1%枸橼酸盐缓冲液配制2%的STZ溶液，一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg，正常对照组和灯盏花素组腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液，并继续高脂喂养，72 h后尾静脉取血测血糖，血糖≥16.7 mmol/L者确定为糖尿病。成模当天作为实验开始时间，将糖尿病大鼠随机分为糖尿病组和糖尿病灯盏花素治疗组。灯盏花素组和糖尿病灯盏花素治疗组大鼠每日腹腔注射灯盏花素20 mg/kg，每天1次，处理16周，同期正常对照组和糖尿病组大鼠每日注射等量生理盐水。各组大鼠处理16周后，过量麻醉处死大鼠，迅速摘除眼球，放入4%多聚甲醛溶液中固定，以备HE染色和免疫组化切片。

2.3免疫印迹法检测细胞VEGF、VEGFR2和p-ERK的蛋白水平收集细胞，用冰PBS洗3次，加入细胞裂解液冰上裂解30 min，4℃15 000×g离心30 min，取上清;BCA法蛋白定量，电泳后转至PVDF膜，5%BSA室温封闭1 h，I抗(VEGF和VEGFR2为1∶500;p-ERK、ERK和GAPDH为1∶1 000)，4℃孵育过夜，II抗(HRP结合抗体为1∶1 000)，室温孵育1 h，暗室孵育发光液、显影。

2.4免疫组化方法、结果判定及病理评分取经4%多聚甲醛溶液固定后的眼球，于锯齿缘后0.5 mm处剪开眼球壁，去除眼前节和玻璃体，余下的眼杯行全层石蜡包埋，5μm连续切片，常规脱蜡后和梯度乙醇水化后，进行HE和免疫组化染色，VEGF抗体稀释度为1∶200，DAB显色时间为5 min，显色后，苏木精复染细胞核，中性树胶封片。在光学显微镜下观察各组大鼠视网膜组织的病理变化及VEGF阳性细胞表达情况。每例标本取6张切片，光镜下每张切片任取5个高倍视野进行细胞计数，至少计数100个细胞，镜下观察出细胞呈棕褐色着色即为阳性表达细胞，输入计算机后用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定视网膜VEGF阳性着色细胞个数，以阳性细胞占细胞总数的百分比表示阳性表达程度。

参照Kohno等［11］评分标准进行病理评分。每例标本取6张切片，光镜下每个切片任取5个高倍镜视野对视网膜病理改变进行评分，计量分析。视网膜病理评分标准为正常记0分;视杆细胞和视锥细胞的破坏记1～2分;外核层的破坏记3～4分;内核层的破坏记5～6分;神经节细胞层破坏记7分。

3统计学处理

所有实验均独立重复3次，统计学处理用SPSS 16.0统计软件，数据以均数±标准误(mean±SEM)表示，行正态性分析及方差齐性检验，方差齐则行单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1高糖、灯盏花素以及高糖联合灯盏花素对ARPE-19细胞分泌VEGF的影响

与正常对照组相比，高糖引起ARPE-19细胞分泌VEGF显著增多，灯盏花素引起ARPE-19细胞分泌VEGF减少，差异显著(P＜0.05)。高糖+灯盏花素处理组的细胞分泌VEGF与单纯高糖组相比有所减少，相对于单纯高糖组差异都具有统计学意义(P＜0.05)，见图2。

Figure 2.Scutellarin(SCU)inhibited the increased release of VEGF induced by high glucose.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs high glucose.图2　高糖以及灯盏花素对ARPE-19细胞分泌VEGF的影响

2高糖、灯盏花素以及高糖联合灯盏花素对ARPE-19细胞VEGF、p-ERK和VEGFR2蛋白水平的影响

Western blot检测发现，和正常对照组相比，灯盏花素组的VEGF、p-ERK和VEGFR2蛋白水平均降低;单纯高糖组的VEGF、p-ERK和VEGFR2蛋白水平均增加，差异显著(P＜0.05)。高糖+灯盏花素处理组相对于单纯高糖组的VEGF、p-ERK和VEGFR2蛋白水平降低，差异显著(P＜0.05)，见图3。

3各组大鼠视网膜病理结构观察

正常对照组大鼠视网膜内界膜完整，表面光滑，各层组织结构清晰;灯盏花素组大鼠视网膜病理结构和正常对照组大鼠无明显差异;糖尿病组大鼠视网膜内界膜增生、紊乱，表面失光滑，血管腔面不规则扩张，腔内可见红细胞分布，管壁变薄，可见未突出内界膜的新生血管芽;糖尿病灯盏花素处理组视网膜组织病变较糖尿病组轻，但仍然可见扩张不明显的小血管，见图4。视网膜病理评分显示:正常对照组和灯盏花素组病理评分差异不显著，但正常对照组和糖尿病组、糖尿病灯盏花素处理组病理评分相比差异有统计学意义(P＜0.05);糖尿病组和糖尿病灯盏花素处理组病理评分相比差异有统计学意义(P＜0.05)。

4各组大鼠视网膜免疫组化检测VEGF蛋白水平的变化

糖尿病组大鼠视网膜和正常对照组相比，VEGF表达明显增加，糖尿病+灯盏花素处理组较糖尿病组的VEGF表达显著减少(P＜0.05)，但正常对照组大鼠视网膜和灯盏花素组大鼠视网膜VEGF表达差异没有统计学意义(P＞0.05)，见图5。

Figure 3.The effects of high glucose and scutellarin(SCU)on the expression of VEGF，VEGFR2 and p-ERK in ARPE-19 cells.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs high glucose.图3　高糖以及灯盏花素对ARPE-19细胞VEGF、VEGFR2和p-ERK蛋白表达水平的影响

Figure 4.The pathological changes and scores of retinas of the diabetic rats treated with scutellarin(SCU).Mean±SEM.n=10.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs diabetes.图4　各组大鼠视网膜组织的病理变化和评分

Figure 5.The expression of VEGF in the retina of the diabetic rats treated with scutellarin(SCU).Mean±SEM.n=10.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs diabetes.图5　VEGF在各组大鼠视网膜组织中的表达

讨论

糖尿病视网膜病变是糖尿病常见且不可逆转的最严重的并发症，主要引起视网膜微血管系统的损害，毛细血管肿胀变形，血-视网膜屏障破坏和视网膜新生血管形成［1］。一直以来，高血糖被认为是糖尿病视网膜病变的主要因素［12］。在糖尿病环境下，细胞内外糖浓度升高，末期糖基化产物累积增加，缺氧和氧化应激都可以引起RPE细胞分泌VEGF增多［13］。在DR的发生发展过程中，VEGF都是关键性的因子，VEGF可以增加视网膜内皮血管渗透性，又可以通过调控其它细胞因子，介导视网膜微血管渗漏，造成视网膜水肿;也可以介导视网膜血管内皮细胞的增殖，直接参与血管新生的过程。临床研究证实DR患者的玻璃体液体中VEGF的含量明显上升，并且与视网膜新生血管化的进程一致［14］，抑制VEGF的产生及其受体的过度表达可以延缓DR病变的发生发展［15］，因此可以抑制VEGF表达的药物有望成为糖尿病视网膜病变的有效治疗药物。

灯盏花素是从灯盏花中提取的黄酮类有效成分，包括灯盏乙素和灯盏甲素，可扩张微动脉，减轻白细胞黏附性，降低血浆黏度，增强组织灌注，改善微循环代谢，已广泛应用于心脑血管疾病及肾病等微循环性疾病［7，10］。

本实验通过观察灯盏花素对ARPE-19细胞和糖尿病大鼠视网膜VEGF表达的影响，来探讨灯盏花素抑制糖尿病视网膜病变的作用机制。通过ELISA检测各组VEGF的分泌，发现ARPE-19细胞在高糖环境下VEGF的分泌显著增加，灯盏花素组的细胞分泌VEGF与正常对照组相比有所减少，高糖+灯盏花素处理组的细胞分泌VEGF与单纯高糖组相比有所减少。VEGF有2种受体(VEGFR1和VEGFR2)，其中VEGFR2，又称FLK-1，存在于血管和淋巴管内皮等处，在生理和病理血管新生中，VEGFR2均是主要的信号转导蛋白，通过自身磷酸化，触发下游一系列信号通路促进血管的发生。VEGF可与VEGFR2结合，经MAPK通路，激活ERK1/2，参与调解血管新生。Western blot实验表明，灯盏花素不但抑制正常环境下ARPE-19细胞的VEGF过表达，还可以抑制其受体VEGFR2的表达及其下游ERK的磷酸化。以上结果提示灯盏花素在正常环境下即对ARPE-19细胞VEGF及其受体VEGFR2下游相关蛋白即有抑制作用，因此灯盏花素对ARPE-19细胞VEGF分泌及其受体VEGFR2下游相关蛋白的作用是否与高糖环境相关还有待进一步的实验研究。

大量的研究报道了糖尿病视网膜病变后，视网膜组织结构增生、紊乱，毛细血管内皮细胞肿胀变形，新生小血管增多，新近的研究还发现，视网膜组织中的VEGF沉积量与视网膜的病变程度成正比［1，4］。为了进一步验证体外实验的结果，我们通过腹腔注射STZ后给予高糖饮食构建了大鼠糖尿病模型。HE和免疫组化染色发现在对照组视网膜中，血管新生增加，表面失光滑，结构紊乱，证实了大鼠糖尿病模型存在严重的视网膜病变。在糖尿病灯盏花素治疗组中，灯盏花素可以明显减轻糖尿病所致的视网膜病变，可以显著减少VEGF在视网膜中的沉积，并且糖尿病灯盏花素处理组大鼠视网膜的病理评分和糖尿病组大鼠视网膜的病理评分差异显著，这些结果提示灯盏花素可能通过降低VEGF的表达，减少VEGF和VEGFR2的结合，阻止MAPK通路的激活，从而减少血管的新生，达到延缓糖尿病视网膜病变进程。但灯盏花素组大鼠视网膜和正常对照组大鼠视网膜的病理评分和VEGF沉积量差异并没有统计学意义，提示灯盏花素对正常状态下大鼠视网膜的影响并不大，与离体细胞实验的结果不完全一致，这究竟是由于人的细胞与鼠的视网膜组织之间存在种系差异还是由于本实验中样本例数较少，有待进一步证实。

总之，上述结果提示灯盏花素在正常环境下即对ARPE-19细胞VEGF及其受体VEGFR2下游相关蛋白即有抑制作用，但灯盏花素能够减低糖尿病大鼠视网膜VEGF的含量，延缓糖尿病视网膜病病程，因此其在预防和治疗糖尿病视网膜方面有一定的应用前景，对将其应用于预防和治疗糖尿病视网膜病变方面还需大量的临床随机对照研究才能造福于病人。

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Effect of scutellarin on VEGF expression in human retinal pigment epithelial cells and retinas of diabetic rats

WANG Jing-nan1，YANG Li-qun2，DENG Yu-bin1
(1Research Center of TranslationalMedicine，The First Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China;2Institute of Polymer Science，School of Chemistry and Chemical Engineering，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China.E-mail:dengyub@mail.sysu.edu.cn)

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.023

1000-4718(2015)05-0900-06

2015-01-08［修回日期］2015-03-11

广东省教育部产学研结合项目(No.2012B091100457)

Tel:020-87755766;E-mail:dengyub@mail.sysu.edu.cn