田甜，张金娟，罗新华，谢汝佳，韩冰，杨婷，陈腾祥，杨勤(贵阳医学院病理生理学教研室，贵州贵阳550000)

大鼠原代肝星状细胞活化后组蛋白修饰水平的观察*

田甜，张金娟，罗新华，谢汝佳，韩冰，杨婷，陈腾祥，杨勤△
(贵阳医学院病理生理学教研室，贵州贵阳550000)

目的:观察体外培养大鼠肝星状细胞(HSCs)活化过程中组蛋白修饰的改变以及与HSCs活化指标α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的关系，探讨组蛋白修饰在HSCs活化过程中可能的作用。方法:体外分离、鉴定、培养大鼠HSCs，光镜观察HSCs活化过程中的形态变化，细胞免疫荧光染色和Western blotting检测desmin和α-SMA的表达，比较静止型HSCs和激活型HSCs中H4K12乙酰化、H3K9乙酰化、H3K4二甲基化和H3K9二甲基化的变化。结果:(1)细胞形态学观察结果表明HSCs在培养过程中形态由静息状态向高度分化的肌成纤维细胞转化。细胞免疫荧光染色及Western blotting检测结果显示，分离培养24 h的HSCs有desmin表达，但几乎不表达α-SMA;随着培养时间延长，HSCs内α-SMA和desmin表达逐步增加，至15 d时达到最大。(2)根据HSCs细胞形态变化及HSCs活化标志蛋白检测结果，确定培养24 h的HSCs为静止型HSCs，培养15 d的HSCs为激活型HSCs，分别检测其组蛋白修饰变化。结果显示，与静止型HSCs比较，激活型HSCs中H4K12乙酰化、H3K9乙酰化和H3K9二甲基化修饰水平明显降低(P＜0.01)，而H3K4二甲基化修饰水平明显增加(P＜0.01)，且H3K4二甲基化修饰水平变化与α-SMA表达变化一致。结论:在体外培养HSCs活化过程中，组蛋白修饰发生明显异常，提示组蛋白修饰改变有可能参与了HSCs活化以及肝纤维化的发生。

肝星状细胞;组蛋白修饰;肝纤维化

［KEY WORDS］Hepatic stellate cells;Histonemodifications;Liver fibrosis

近年来研究表明，肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活是肝纤维化形成的中心环节，HSCs自分泌的多种细胞因子作用于HSCs表面的受体，通过细胞内信号转导，不断刺激HSCs自身分裂增殖，并大量合成和分泌胶原等细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)在肝内沉积，最终导致肝纤维化［1］。表观遗传是不通过DNA序列改变就能影响基因表达的、可遗传的调控方式，包括DNA甲基化、微小RNA(microRNA，miRNA)和组蛋白修饰等。近来有研究提示，表观遗传机制在肝星状细胞激活过程中可能起重要调控作用。Chen等［2］研究发现，大鼠HSCs由静止状态转为活化状态后miR-335和miR-150表达发生显著下调，而miR-143、miR-145和miR-121却明显上调，认为这些在肝纤维化进程中差异表达的miRNA可靶向调控HSCs活化增殖相关的细胞因子或蛋白，调控HSCs的活化增殖，进而参与肝纤维化发生发展。Bian等［3］的研究发现PTEN基因高甲基化可激活PI3K/AKT与ERK通路来参与HSCs的活化及肝纤维化的形成。然而，组蛋白修饰作为表观遗传的一个重要内容，其是否参与HSCs活化及ECM产生的调控，目前仍不清楚。组蛋白修饰主要包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，其中以组蛋白的乙酰化和甲基化研究最多。这些修饰可作为一种标记或语言组成“组蛋白密码”，被一系列特定的蛋白质所识别，并将其转译成一种特定的染色质状态以实现对特定基因的调节。本实验拟分离培养大鼠原代HSCs，观察HSCs在活化前后组蛋白修饰4个位点水平变化，了解在HSCs激活过程中组蛋白修饰的变化以及与HSCs产生的ECM的相关性，以探讨组蛋白修饰在HSCs活化中可能的作用及与肝纤维化发生的关系。

材料和方法

1实验动物

清洁级雄性Wistar大鼠，体重400～500 g，由贵州省实验动物中心提供，合格证编号为(黔)2003-001。

2主要试剂

DNaseⅠ购自Solarbio;IV型胶原酶购自Sigma; Opetiprep密度梯度离心液购自Axis-Shield;DMEM培养基购自HyClone;胎牛血清购自Gibco;强细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒、兔抗H3K9me2、兔抗H3K4me2、Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG(H+L)以及DyLight 549标记山羊抗兔IgG(H+L)购自上海碧云天生物技术有限公司;鼠抗α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)单抗购自Santa Cruz;兔抗desmin、兔抗acH4K12、兔抗acH3K9和兔抗GAPDH抗体购自Bioworld。

3主要方法

3.1原代HSCs的分离和培养大鼠HSCs的分离参考戴春蕾等［4］的方法。细胞分离后，用台盼蓝染色鉴定细胞活率。以含20%胎牛血清及双抗的DMEM培养液调整细胞浓度为1×1010/L，接种于6 cm无包被塑料培养皿和激光共聚焦皿中，置于5% CO2、37℃CO2培养箱中培养。接种24 h后首次换液，以后每2～3 d换1次液。并于倒置显微镜下观察细胞形态学变化。

通过上述方法分析得出，3阶模态的振型图是独立的，表5显示与其他模态置信度相比很低，所以其为真实模态。1阶模态与2阶模态的频率接近，二者振型图为对称2点间的上下振动。4阶与5阶模态的频率接近，振型图均为边缘弯曲振动。6阶模态与7阶模态的频率接近，振型图为内部的扭转振动。对比MAC值，发现第1阶模态与第2阶模态的置信度很高，确认二者为重根模态。分析4阶与5阶模态为密集模态或重根模态，进行二级验证。

3.2细胞免疫荧光法观察HSCs中desmin和α-SMA的表达吸弃激光共聚焦皿内培养液，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，3%BSA封闭1 h，滴加1∶50稀释的兔抗desmin抗体(或1∶50稀释鼠抗α-SMA)，4℃孵育过夜，加入1∶200稀释的Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)［或1∶100稀释的DyLight549标记山羊抗兔IgG(H+L)］，室温孵育2 h，PBS洗涤后DAPI染核，在激光共聚焦显微镜下观察。

3.3Western blotting检测HSCs中α-SMA、desmin、acH4K12、acH3K9、H3K9me2以及H3K4me2的修饰水平吸弃培养液，预冷PBS洗涤后以细胞裂解液冰上裂解细胞，高速离心后收集上清，BCA试剂盒检测细胞总蛋白。蛋白定量后进行加样，上样量为40μg，行12%SDS-PAGE分离蛋白，电转移至硝酸纤维素膜，含5%脱脂奶粉的TBST封闭，分别加入1∶1 000稀释的鼠抗α-SMA抗体、1∶1 000稀释兔抗desmin抗体、1∶500稀释兔抗acH4K12抗体、1∶500稀释兔抗acH3K9抗体、1∶1 000稀释兔抗H3K9me2抗体、1∶1 000稀释H3K4me2抗体和1∶10 000稀释的GAPDH抗体，4℃过夜。次日TBST洗膜，辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗室温孵育1 h，TBST洗膜，ECL显示特异条带。GAPDH抗体作为内参照。利用GeneTools图像分析软件对每个条带灰度进行定量分析。

4统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示。采用SPSS 17.0统计软件包处理。两组样本均数比较采用两个独立样本的t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1分离HSCs的得率、存活率及纯度

光镜下计数分离得到的HSCs，台盼蓝染色判断细胞存活率。结果显示，每只大鼠肝脏分离纯化后HSCs的细胞得率约为4.0×107，细胞存活率为95%。以desmin免疫荧光染色显示原代HSCs结果表明阳性率为96%，见图1。

Figure 1.Desmin expression in HSCs at24 h observed by immunofluorescence(×200).图1　细胞免疫荧光检测desm in在培养24 h的HSCs中的表达

2体外培养过程中大鼠原代HSCs的形态变化

镜下观察刚分离的HSCs呈折光性很强的圆球形，培养24 h后细胞基本贴壁，胞质内含大量折光性强的颗粒。随培养时间增加，细胞逐渐伸展，培养3 d时细胞体较大，胞质内含较多折光性强颗粒，开始伸出伪足。第5～10天细胞内折光性强的颗粒逐渐减少，细胞继续伸展，开始融合成片。第15天时，细胞内折光性强颗粒明显减少，绝大多数细胞呈典型星形，梭形，融合成片，见图2。

Figure 2.Themorphological changes of HSCs isolated from rats during the culture(×200).图2　不同培养时间大鼠肝星状细胞形态学观察

3体外培养HSCs过程中α-SMA和desm in免疫荧光染色

分别用黄色荧光和绿色荧光标记desmin和α-SMA蛋白，在激光共聚焦显微镜下观察可见:分离培养24 h的HSCs中有desmin阳性表达，而几乎没有α-SMA阳性表达;分离培养3 d后的HSCs desmin阳性表达逐渐增多(＞90%)，并可见较多α-SMA阳性表达(＞85%);随着培养时间延长，HSCs中desmin及α-SMA阳性明显增多，至培养15 d时几乎所有的HSCs中都有desmin和α-SMA阳性表达(＞98%)，且在细胞中可见细胞骨架呈典型的肌丝状条纹，见图3、4。

Figure 3.The expression ofα-SMA in the HSCs cultured at different time points observed by immunofluorescence(×200).图3　α-SMA在不同培养时间的HSCs中的免疫荧光观察

4Western blotting检测HSCs培养过程中α-SMA和desm in蛋白的表达

Western blotting结果显示，在HSCs分离培养的不同时期都有desmin蛋白表达，且desmin蛋白表达量随着培养时间延长而增加。分离培养24 h的HSCs基本不表达α-SMA，培养3 d后的HSCs开始表达α-SMA，且α-SMA的表达随培养时间增加逐渐增加，至15 d时α-SMA的表达量达到最大，见图5。

Figure 4.The expression of desmin in the HSCs cultured at different time points observed by immunofluorescence(×200).图4　Desm in在不同培养时间的HSCs中的免疫荧光

Figure 5.The expression ofα-SMA and desmin in the HSCs cultured at different time points detected by Western blotting.Mean± SD.n=5.*P＜0.05 vs24 h.图5　α-SMA和desm in在不同培养时间的HSCs中的表达

5Western blotting检测培养24 h HSCs和培养15 d的HSCs中组蛋白acH4K12、acH3K9、H3K9me2和H3K 4m e2修饰水平

根据培养细胞内desmin及α-SMA蛋白表达情况分别将培养24 h、3 d和15 d HSCs视为静止HSCs、部分活化HSCs和完全活化HSCs。我们选取培养24 h HSCs(静止HSCs)和培养15 d HSCs(激活HSCs)作为研究对象，用Western blotting检测其组蛋白修饰情况。结果显示，培养15 d HSCs中H4K12和H3K9乙酰化修饰水平明显较培养24 h HSCs降低(P＜0.01)。进一步检测HSCs细胞中组蛋白甲基化水平的结果显示，与培养24 h HSCs相比，培养15 d的HSCs中H3K4二甲基化水平明显增高，组蛋白H3K9甲基化水平明显减低(P＜0.01)，见图6。

Figure 6.The expression of acH4K12，acH3K9，H3K9me2 and H3K4me2 in 24 h HSCs and 15 d HSCs isolated from the rats.Mean ±SD.n=5.*P＜0.01 vs24 h HSCs.图6　静止型和激活型HSCs中acH4K12、acH3K 9、H3K 9me2和H3K4me2的修饰水平

讨论

肝星状细胞位于肝窦内皮与肝细胞之间的Disse间隙内，呈典型的树突状突起星芒状结构，以表达desmin等间质标记为特征［5］。在生理状态下，HSCs呈静止状态，其主要功能是储存和代谢维生素A，合成和分泌少量ECM，但不表达α-SMA。当各种因素造成肝细胞损伤时，在肝细胞和其它非实质细胞分泌的细胞因子作用下，HSCs形态由星状变成梭形，脂滴消失，变成肌成纤维样细胞，表达α-SMA，转变成为激活型HSCs，后者产生大量ECM在肝脏内沉积，形成肝纤维化。有研究发现，在无包被的塑料培养皿上培养静止型HSCs，随着培养时间延长，静止型HSCs可发生自发活化，其形态变化及标志物表达的改变与体内肝纤维化发生过程中HSCs变化相似［6］。静止型的HSCs不表达α-SMA，故α-SMA被认为是HSCs活化的标志，其表达量的大小可用来衡量HSCs激活程度，也可以反映活化HSCs分泌ECM量［7］。

本实验采用体外胶原酶循环灌注结合密度梯度离心法分离得到原代HSCs后，在镜下观察到刚分离的HSCs呈圆球形，培养24 h后细胞基本贴壁，胞质内含大量折光性强的颗粒;随培养时间增加，细胞逐渐伸展，培养3 d时开始伸出伪足，培养5～10 d时细胞继续伸展，胞内折光性强的颗粒逐渐减少，培养第15天时，绝大多数细胞呈典型星形，梭形，融合成片。这与文献报道中HSCs形态变化相符。我们通过细胞免疫荧光染色和Western blotting分别对不同培养时间的HSCs细胞内desmin和α-SMA表达进行检测，以期对分离得到的细胞进行鉴定，结果显示，分离培养24 h的HSCs细胞表达desmin但不表达α-SMA，分离培养3 d的HSCs细胞持续表达desmin并开始表达一定量的α-SMA，而培养15 d的HSCs细胞显示高表达desmin和α-SMA，且在细胞内可见细胞骨架呈明显肌丝样条纹，其形态学变化及细胞活化标志物变化与既往文献报道一致，由此我们初步认定分离培养24 h HSCs细胞为静止型HSCs，分离培养3 d的HSCs为部分活化型HSCs，而培养15 d的HSCs为完全激活型HSCs。鉴于本文主要研究研究HSCs由静止型转变为激活型后组蛋白修饰变化，故选用培养24 h HSCs和15 d HSCs作为研究对象。

组蛋白修饰是表观遗传学的重要组成部分。有关肝纤维化的表观遗传学研究已经发现DNA甲基化和微小RNA都参与HSCs激活的调控，推测组蛋白修饰有可能也参与其中。组蛋白有多种共价修饰方式，其中H3K9乙酰化、H4K12乙酰化、H3K4me2和H3K9me2是修饰基因转录调控的重要机制［8］。一般认为组蛋白乙酰化修饰中和其氨基端赖氨酸残基的正电荷，削弱了组蛋白与DNA的接触，DNA易于解聚，染色质呈转录活性结构，进而激活基因转录。组蛋白乙酰化状态受组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶调控，取决于两者的动态平衡［9］。有研究发现H3K4me2使组蛋白和DNA结构由紧变松，靶基因才能和转录复合物相互作用而得以转录［10］。还有研究认为H3K9me2能使组蛋白形成一个异染色质蛋白1(heterochromatin protein 1)结合位点，导致DNA分子上特定CpG岛的甲基化而使基因沉默［11］。不同组蛋白修饰可依次发挥作用或组合在一起，形成一个修饰的级联，通过协同或拮抗来共同发挥调节作用。我们对静止型HSCs与激活型HSCs acH4K12、acH3K9、H3K9me2及H3K4me2观察的实验结果表明，分离培养15 d(激活型)HSCs中H4K12乙酰化水平较培养24 h(静止型)HSCs明显降低，这一结果与Qin等［12］发现大鼠HSCs培养活化过程中H4K12乙酰化水平逐渐减少的研究结果一致。此外Qin等［12］还发现肝纤维化大鼠MMP13基因启动子区H4总乙酰化水平也是减少的，认为MMP13基因H4总乙酰化水平降低会抑制MMP13基因的转录，以致没有足够的MMP13蛋白来降解ECM，导致ECM在肝内沉积是最终引起肝纤维化的根本原因。我们还发现激活型HSCs中H3K9乙酰化水平也较静止型HSCs为低，但α-SMA的表达却较静止型HSCs明显增加。结合我们实验室及其他学者以往的研究发现在肝纤维化大鼠肝脏HSCs活化增殖的同时伴有肝脏MMP-1等基质金属蛋白酶表达增加，细胞外基质成分明显增多的结果［13］，我们推测激活型HSCs中H4K12乙酰化水平降低有可能参与胶原代谢相关酶基因调控而参与肝纤维化的发生。有学者用去乙酰化酶抑制剂拉格唑拉处理大鼠原代激活型HSCs后，发现伴随着组蛋白3和组蛋白4的总乙酰化水平明显增加，而HSCs中α-SMA、Ⅰ型胶原和TIMP-1的表达明显降低［14］，表现出抗肝纤维化效应的结果也进一步支持我们的推测。有关激活型HSCs中H4K12乙酰化水平改变如何调控胶原代谢相关酶基因的机制尚有待进一步研究。

在本研究中我们还发现激活的HSCs中H3K4me2水平增加和H3K9me2水平减少，表明在HSCs活化过程中存在组蛋白H3K4me2和H3K9me2修饰改变。有研究发现在肝硬化患者肝组织中H3K4me2的去甲基化转移酶RBP2和α-SMA表达上调，通过沉默LX-2 HSCs中RBP2基因后发现α-SMA表达下调同时HSCs增殖抑制，过表达LX-2 HSCs中RBP2基因后发现α-SMA的表达上调，因此认为RBP2调控了肝硬化患者肝脏中α-SMA的表达，从而参与肝硬化的病理过程［15］。由此我们认为激活型HSCs中H3K4me2修饰改变与α-SMA表达上调及肝纤维化发生可能存在某种联系。有学者发现在正常脑组织中存在H3K4me2修饰，而在星形细胞瘤中H3K4me2修饰水平增加，且随星形细胞瘤病理分级的增高而增高［16］，提示H3K4me2修饰可能是星形细胞增殖的一个标志。因此，我们推测在激活的HSCs中发现的H3K4me2修饰水平的改变也可能是HSCs活化增殖的一个标志，可成为判断肝纤维化进展的一个指标。

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Levels of histonemodifications in activated primarily cultured rat hepatic stellate cells

TIAN Tian，ZHANG Jin-juan，LUO Xin-hua，XIE Ru-jia，HAN Bing，YANG Ting，CHEN Teng-xiang，YANG Qin
(Department of Pathophysiology，Guiyang Medical University，Guiyang 550000，China.E-mail:qinyang@gmc.edu.cn)

R329.2+1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.018

1000-4718(2015)05-0871-06

2014-10-24［修回日期］2015-02-05

国家自然科学基金资助项目(No.81160064);贵州省科技厅联合基金［黔科合LG字(2012)023号］

Tel:0851-6908489;E-mail:qinyang@gmc.edu.cn