彭璇，黄德斌，严米娅，彭世军(湖北民族学院医学院，恩施州中心医院，湖北恩施445000)

人参皂苷Rg1通过调节脂肪代谢改善非酒精性脂肪肝病大鼠的肝功能*

彭璇1△，黄德斌1，严米娅1，彭世军2
(1湖北民族学院医学院，2恩施州中心医院，湖北恩施445000)

目的:研究人参皂苷Rg1对高脂饮食(HFD)诱导的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)大鼠肝脏β-氧化的作用。方法:60只SD大鼠随机分为对照组(CON)、HFD组、人参皂苷Rg1低、中、高剂量干预组(LDG、MDG及HDG)及阳性药物熊去氧胆酸钠治疗组(PDT)。HFD 8周后成功复制NAFLD模型，之后用相应药物治疗，治疗4周和8周后分别处死大鼠各半，收集肝脏做切片HE染色，同时检测其肝功能和血脂指标，RT-PCR及Western blotting测定肝脏脂酰CoA合成酶1(CoASH1)、肉毒碱脂酰转移酶I(CATI)及脂酰CoA氧化酶1(ACOX1)mRNA和蛋白的表达。结果:治疗4周后，肝脏HE染色除HDG组有改善外，PDT组、LDG组及MDG组的脂肪肝浸润现象没有改善;治疗8周后，PDT组与LDG组仍有少量脂肪颗粒聚集，而MDG组和HDG组则看不到脂滴浸润现象;治疗4周后，PDT组、LDG组、MDG组及HDG组与HFD组相比，肝功能指标AST、ALT、AKP以及血脂指标TC、TG、LDLC明显降低(P＜0.05)，治疗8周后进一步降低;治疗4周后，4个治疗组HDL-C均明显升高，8周后几乎恢复到CON组的水平;治疗4周后4个治疗组肝脏组织的CoASH1、CACTI及ACOX1表达均有显著升高(P＜0.05)，治疗8周后改善更为明显，同时MDG组与HDG组表达要高于PDT组(P＜0.05)。结论:人参皂苷Rg1可通过调节大鼠β-氧化相关的酶改善脂肪代谢对NAFLD大鼠的肝损伤，从而发挥治疗作用。

人参皂苷Rg1;非酒精性脂肪肝病;脂酰辅酶A合成酶1;肉毒碱脂酰转移酶I;脂酰辅酶A氧化酶1

［ABSTRACT］AIM:To investigate whether ginsenoside Rg1 attenuates high-fat diet(HFD)-induced non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)by improvingβ-oxidation.METHODS:SD rats(n=60)were randomly divided into control group(CON)，HFD group，low-dose，medium-dose and high-dose ginsenoside Rg1 groups(LDG，MDG and HDG)and positive drug(sodium ursodeoxycholate)treatment group(PDT).High-fat dietwas given for 8 weeks to successfully establish an NAFLDmodel.The animalswere treated with the appropriatemedications for4 weeks and 8 weeks aftermodeling，and sacrificed to collect the liver tissues for observing the pathologic changeswith HE staining and for detecting liver functions and lipid levels.The expression of hepatic acyl-CoA synthetase 1(CoASH1)，carnitine acyltransferase I(CATI)and acyl-CoA oxidase 1(ACOX1)atmRNA and protein levels was determined by RT-PCR and Western blotting.RESULTS:After 4-week treatment，the fatty infiltration of the liver tissues in PDT group，LDG group and MDG group was not attenuated except HDG group.After 8 weeks of treatment，a small number of fat particles was observed in PDT group and LDG group，while no infiltration of lipid dropletwas found in MDG group and HDG group.Compared with HFD group，the levels of AST，ALT，AKP，TC，TG and LDL-Cwere significantly decreased after4-week treatment in PDT group，LDG group，MDG group and HDG group(P＜0.05)，these indexes were further reduced after 8-week treatment.After 4-week treatment，HDL-C was significantly increased in the 4 treatment groups and almost restored to the level ofCON group after 8-week treatment.The levels of CoASH1，CACTIand ACOX1 in the liver tissue of the 4 treatment groups were significantly increased after 4-week treatment(P＜0.05)and much improved after 8-week treatment，and those in MDG group and HDG group were better than those in PDT group(P＜0.05).CONCLUSION:Ginsenoside Rg1 regulates β-oxidation-related enzymes to improve the fatmetabolism，thus playing a therapeutic role in liver injury in the rats with NAFLD.

［KEY WORDS］Ginsenoside Rg1;Non-alcoholic fatty liver disease;Acyl-CoA synthetase 1;Carnitine acyltransferase I;Acyl-CoA oxidase 1

近年来随着人们生活水平的提高以及饮食结构的改变，非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的发病率有逐年升高的趋势。在我国城市地区，本病的发病率已经超过30%［1］，NAFLD在临床上属于一种没有酒精及其它明确的肝脏损害因素所引起的一种肝脏脂代谢障碍型疾病［2］。本病疾病谱较广，其包括由高脂饮食造成的单纯性非酒精性脂肪肝病及后续发展形成的非酒精性脂肪肝炎、肝纤维化、肝硬化等［3］。人参皂苷Rg1为人参根部提取的一种单体活性物质［4］，有研究显示人参皂苷Rg1具有促进海马神经发生、增强学习、提高记忆力的作用［5］，同时其还有抗疲劳、辅助抗肿瘤、辅助治疗糖尿病等［6］，但关于其是否可以改善NAFLD症状，国内外均鲜见研究报道［7］。

材料和方法

1动物、药品与试剂

雄性SD大鼠60只，体重为160～180 g，大鼠、基础饲料均由由湖北省实验动物研究中心提供［生产许可证号为SCXK(鄂)2008-0005;使用许可证号为SCXK(鄂)2008-0014］;人参皂苷Rg1购于成都普菲德公司;猪油市场自购;胆固醇及胆酸钠购自上海金穗生物公司;熊去氧胆酸钠购于恩施州中心医院药房;总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)试剂盒购自南京建成生物工程研究所;天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、碱性磷酸酶(alkali phosphatase，AKP)等ELISA试剂盒购自Bio-Swamp;总RNA提取试剂盒购自上海宝曼生物科技有限公司;引物为上海生工生物股份有限公司设计;2× Master PCR Mix购于MBIFermentas;琼脂糖购自Invitrogen;多克隆抗体肝脏脂酰CoA合成酶1(acyl-CoA synthetase 1，CoASH1)、肉毒碱脂酰转移酶I (carnitine acyltransferase I，CATI)和脂酰CoA氧化酶1(acyl-CoA oxidase 1，ACOX1)、单克隆抗体β-actin以及ECL发光试剂盒购自Santa Cruz;相应羊抗鼠II抗购于中杉金桥公司。

2方法

2.1大鼠造模方法参考国际上通用的NAFLD造模饲料配方［8］配制大鼠高脂饲料，具体为20%的猪油、2%胆固醇与0.5%胆酸钠加77.5%的常规饲料配成100%高脂饲料，大鼠由其自由饮食，时间为8周，之后取肝脏行病理学HE染色检查，观察是否造模成功。

2.2非酒精性脂肪肝模型的建立及给药方法将60只SD大鼠随机分为对照组(control，CON)、高脂饮食组(high-fat diet，HFD)、人参皂苷Rg1低、中、高剂量干预组(LDG、MDG、HDG)及阳性药物熊去氧胆酸钠治疗组(positive drug treatment，PDT)，每组分别为10只。造模成功后CON组及HFD组均以生理盐水灌胃作为对照;LDG组、MDG组和HDG组分别灌胃人参皂苷Rg1针剂5 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/ kg进行治疗，连续灌胃8周，每日1次;PDT组经灌胃熊去氧胆酸钠针剂10 mg/kg进行治疗，连续灌胃8周，每日1次。

2.3标本采集处死大鼠前，手术台进行严格消毒，所有操作人员要求戴手套及口罩，之后按不同组别称取大鼠体重、3%水合氯醛腹腔内注射3mL麻醉大鼠;大鼠在麻醉后立即绑定在解剖板上;暴露腹腔迅速取出肝脏，之后用10mL注射器心脏心尖处缓慢抽血;取出血液后4 000 r/min离心，收集血清，最后将血清和肝脏置于－80℃超低温冰箱保存备用。

2.4病理学检查方法取出肝脏500 mg，用4%中性福尔马林浸泡24 h，之后取出用乙醇作为脱水剂从低浓度到高浓度缓慢给予肝脏组织脱水，脱水后消除组织中残余水分，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察肝脏病理学改变。

2.5生化指标检测方法总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白的测定方法为酶法，天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶及碱性磷酸酶测试方法为双抗体夹心法。

2.6RT-PCR检测mRNA的表达从低温冰箱中取出肝脏组织，用微量天平称取30 mg，称取后立即用总RNA提取试剂盒提取总RNA，提取总RNA后立即定量，定量后每组各取2μg逆转录cDNA，其余总RNA置于超低温冰箱保存，用逆转录试剂盒提供的配置液行PCR反应扩增，PCR扩增的条件完全按照引物说明书进行，目的片段扩增后在110 V、1μL GeneFinder以及1.6%琼脂糖凝胶中电泳30 min，电泳完成后用凝胶成像仪拍照收集条带图像，采集图像后用ImageJ计算各条带荧光值，全部实验均用βactin作内参照，每组实验重复3次。

β-actin的上游引物为5’-GTGACGAGGCCCAGAGCAAGAG-3’，下游引物为5’-ACGCAGCTCATTGTAGAAGGTGTGG-3’，产物长度为123 bp; CoASH1的上游引物为5’-CTTCGGTCGTGATGAAAGGA-3’，下游引物为5’-ATAGCTGACGGTTGCCGTAC-3’，产物长度为158 bp;CATI的上游引物为5’-CTTGCATGGCTGTGAGAAGA-3’，下游引物为5’-AGTCGGACTGCCTTCAGTGA-3’，产物长度为188 bp。ACOX1的上游引物为5’-GTTACGTGGCGCATTGAAGA-3’，下游引物为5’-TAGTTCCTCGCGGGAACGAT-3’，产物长度为169 bp。

2.7Western blotting检测蛋白表达称取肝脏组织100 mg，称重后立即放入组织裂解液，电动匀浆机制作匀浆，匀浆液磨好后，4 000 r/min离心，收集上清液，BCA法定量，定量后取各样本60μg进行SDSPAGE，其余流程均按照常规方法操作，暗室内与ECL发光试剂反应，曝光洗片，扫描图像后用ImageJ计算各条带荧光值，全部试验均用β-actin(1∶800)作内参照，羊抗鼠II抗浓度为1∶2 000。每组实验重复3次。

3统计学处理

数据处理分析均用SPSS 19.0软件，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，组间计量资料比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1肝脏切片的HE染色观察

肝脏切片HE染色结果，CON在治疗4周和8周后均无任何脂滴浸润现象;HFD组在治疗4周后和治疗8周后脂肪空泡数量仍然较多，同时有不同程度的细胞变性及炎症反应;治疗4周后，4个治疗组的脂肪空泡明显减少，治疗8周后4个治疗组的脂肪空泡进一步减少，PDT组仍然有一定的脂肪空泡，但没有炎症反应;而LDG组略有一定量的空泡外还有轻微的炎症反应;MDG组以及HDG组几乎看不到脂肪空泡及炎症反应，见图1。

Figure 1.The pathological changes of liver tissues in the rats with different treatments for differentweeks(HE staining，×200).图1　不同治疗周数肝脏HE染色切片

2肝功能的变化

治疗4周后，HFD组与CON组相比，AST、ALT及AKP的水平明显增高(P＜0.05)，说明HFD组造模成功;PDT组、LDG组、MDG组及HDG组与HFD组相比，AST、ALT及AKP的水平明显降低(P＜0.05)，同时可看出PDT组的改善没有LDG组、MDG组及HDG组明显;治疗8周后，PDT组、LDG组、MDG组及HDG组与HFD组相比，AST、ALT及AKP相较于4周前各组进一步降低，已经基本接近于CON组的水平，同时可发现PDT组的AST、ALT及AKP水平与LDG和MDG组相近但仍然没有HDG组降低的幅度大，见表1。

表1　不同治疗处理对大鼠肝功能的影响Table 1.The changes of the liver functions in the ratswith different treatments(U/L.Mean±SD.n=5)

3血脂的变化

治疗4周后，HFD组与CON组相比，TC、TG以及LDL-C的水平明显增高(P＜0.05)，与此同时，HLD-C的水平明显降低(P＜0.05)，进一步说明HFD组造模成功;PDT组、LDG组、MDG组及HDG组与HFD组相比，TC、TG及LDL-C的水平明显降低，与此同时，HLD-C的水平明显增高(P＜0.05);同时可看出PDT组的改善没有LDG组、MDG组及HDG组明显;治疗8周后，PDT组、LDG组、MDG组及HDG组与HFD组相比，TC、TG及LDL-C相较于4周各组进一步降低同时HLD-C的水平明显增高，已经基本接近于CON组的水平，还发现PDT组的TC、TG、HLD-C和LDL-C水平与LDG和MDG组相近但仍然没有HDG组降低的幅度大，见表2。

表2　血清脂代谢生化指标的比较Table 2.The biochemical parameters of lipid metabolism of the ratswith different treatments at different time points(mmol/L.Mean ±SD.n=5)

4CoASH1、CATI以及ACOX1蛋白表达的变化

治疗4周后，PDT组、LDG组、MDG组及HDG组与HFD组相比，CoASH1、CATI及ACOX1蛋白的表达均明显升高(P＜0.05)，MDG组及HDG组的CoASH1、CATI及ACOX1蛋白表达均高于PDT组(P＜0.05);治疗8周后，CoASH1、CATI及ACOX1蛋白呈现明显的升高，同时分析可见，PDT组低于LDG组、MDG组及HDG组，与MDG组及HDG组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，见图2～3。

Figure 2.The protein expression of CoASH1，CATIand ACOX1 in the rat liver tissues after 4 weeks of treatment.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs HFD group;#P＜0.05 vs PDT group.图2　治疗4周后大鼠肝组织CoASH 1、CATI及ACOX1的蛋白表达

Figure 3.The protein expression of CoASH1，CATIand ACOX1 in the rat liver tissues after 8 weeks of treatment.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs HFD group;#P＜0.05 vs PDT group.图3　治疗8周后大鼠肝组织CoASH1、CATI及ACOX1的蛋白表达

5CoASH1、CATI及ACOX1 m RNA表达的变化

mRNA与蛋白表达的变化趋势基本相似，但也有一些不同。治疗4周后，PDT组、LDG组、MDG组及HDG组与HFD组相比，CoASH1、CATI及ACOX1 mRNA表达均明显升高(P＜0.05)，MDG组及HDG组的CoASH1、CATI及ACOX1 mRNA表达均高于PDT组(P＜0.05);治疗8周后，CoASH1、CATI以及ACOX1 mRNA表达明显升高，而PDT组低于LDG组、MDG组及HDG组(P＜0.05);PDT组的CoASH1及ACOX1 mRNA表达低于MDG组及HDG组(P＜0.05)，PDT组的CATImRNA表达低于HDG组，见图4～5。

讨论

当前NAFLD已经成为严重威胁人们健康的一大疾病［9］。一般而言，临床上NAFLD轻度患者没有什么特殊症状，只有约25%的患者可出现疲乏感，但如果本病不加以干预、不注意饮食，任其继续发展，可形成中度甚至重度NAFLD，中度与重度NAFLD则会给患者带来诸如全身乏力、肝区隐痛、长期腹泻等影响［10］，甚至有可能导致患者病情进一步发展，最终形成肝纤维化、肝硬化以及肝癌等。当前大多数专家认为NAFLD不应以药物治疗为主，而应该通过改变生活方式进行干预，但最新的研究显示消除或控制NAFLD相关的因素在NAFLD的治疗中不容忽视［11］。

本实验中NAFLD发生时，大鼠肝脏聚集着大量的脂肪空泡，同时伴有一定的炎症反应，其肝功能也会发生明显的异常［12］。本文治疗前后结果显示，肝脏切片HE染色显示CON组在治疗4周和8周后均无任何脂滴浸润现象;HFD组在治疗4周后和治疗8周后脂肪空泡数量很多，同时伴有不同程度的细胞变性及炎症反应，而4个治疗组在治疗4周后，脂肪空泡明显减少、治疗8周后脂肪空泡进一步减少，同时MDG组和HDG组几乎看不到脂肪空泡。治疗4周后，PDT组、LDG组、MDG组及HDG组与HFD组相比，AST、ALT以及AKP的水平明显降低，但PDT组的改善没有LDG组、MDG组及HDG组明显。这提示大鼠肝脏发生了明显的病变，同时肝功能受到影响。而熊去氧胆酸钠以及人参皂苷Rg1均可以清除大鼠肝脏中聚集的脂滴，同时也可以调节肝功能，另外人参皂苷Rg1治疗效果要优于熊去氧胆酸钠。

Figure 4.The mRAN expression of CoASH1，CATI and ACOX1 in the rat liver tissues after 4 weeks of treatment． Mean ± SD． n = 3．*P＜0.05 vs HFD group;#P＜0.05 vs PDT group．图4　治疗4周后大鼠肝脏提取液CoASH1、CATI及ACOX1的mRNA表达

Figure 5.The mRNA expression of CoASH1，CATI and ACOX1 in the rat liver tissues after 8 weeks of treatment． Mean ± SD． n = 3．*P＜0.05 vs HFD group;#P＜0.05 vs PDT group．图5　治疗8周后大鼠肝脏提取液CoASH1、CATI以及ACOX1的mRNA表达

一般而言，在氧供充足的条件下，肝脏中的脂肪酸可经β-氧化分解为乙酰CoA，最终彻底氧化分解为CO2和H2O并释放出大量的能量，其具体过程首先是脂肪酸在CoASH1的催化下活化，生成脂酰CoA，之后在CATI的作用下，脂酰CoA进入线粒体开始其氧化分解，最后脂肪酸经过一系列的反应在ACOX1作用下生成2分子乙酰CoA进而分解代谢成能量［13-15］。本文研究CoASH1、CATI以及ACOX1这3个β-氧化关键酶，RT-PCR与Westernblot的实验结果显示，治疗4周后，PDT组、LDG组、MDG组及HDG组与HFD组相比，CoASH1、CATI及ACOX1的酶蛋白和mRNA表达均明显升高，MDG组以及HDG组3个酶的mRNA表达均高于PDT组;治疗8周后，上述3个酶蛋白和mRNA表达明显升高。另外大鼠在治疗后，血脂4个关键指标均有明显的改善，提示熊去氧胆酸钠以及人参皂苷Rg1均可以通过调节大鼠β-氧化途径来改善其脂代谢，而人参皂苷Rg1治疗效果要好于熊去氧胆酸钠。

本研究的结果提示，用高脂饮食8周所建立的NAFLD大鼠模型具有明显的脂代谢紊乱及肝功能异常;人参皂苷Rg1不仅可通过调节大鼠β-氧化相关的酶，进而改善脂肪代谢对大鼠非酒精性脂肪肝的肝损伤发挥治疗作用，但是其作用机制亟待研究;本次研究还发现人参皂苷Rg1具有降低血脂的功能，但是其是否具有减肥效果以及其机理并未涉及。

［1］Méndez-Sánchez N.Non alcoholic fatty liver disease［J］.Ann Hepatol，2009，8(Suppl 1):S3.

［2］Chen QR，Braun R，Hu Y，et al.Multi-SNP analysis of GWAS data identifies pathways associated with nonalcoholic fatty liver disease［J］.PLoS One，2013，8(7): e65982.

［3］武俊紫，牛世伟，贾亚敏，等.艾塞那肽通过调控PPARa及ACOX1改善大鼠非酒精性脂肪肝病症状［J］.基础医学与临床，2014，34(4):464-469.

［4］Tushuizen ME，Bunck MC，Pouwels PJ，et al.Incretin mimetics as a novel therapeutic option for hepatic steatosis［J］.Liver Int，2006，26(8):1015-1017.

［5］Zhou SS，Xu JD，Zhu H，et al.Simultaneous determination of original，degraded ginsenosides and aglycones by ultra high performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flightmass spectrometry for quantitative evaluation of Du-Shen-Tang，the decoction of ginseng［J］.Molecules，2014，19(4):4083-4104.

［6］Huang SL，He XJ，Li ZF，etal.Neuroprotective effects of ginsenoside Rg1 on oxygen-glucose deprivation reperfusion in PC12 cells［J］.Pharmazie，2014，69(3):208-211.

［7］曹利军.人参皂甙Rg1预处理对Con A诱导肝损伤的保护作用及机制研究［D］.上海:第二军医大学，2013.

［8］陈育尧，石彩霞，陈业豪.大鼠高血脂及脂肪肝模型的建立［J］.中药药理与临床，2007，23(5):216-217.

［9］Berlanga A，Guiu-Jurado E，Porras JA，et al.Molecular pathways in non-alcoholic fatty liver disease［J］.Clin Exp Gastroenterol，2014，7:221-239.

［10］Tok D，Ekiz F，Basar O，et al.Serum endocan levels in patients with chronic liver disease［J］.Int J Clin Exp Med，2014，7(7):1802-1807.

［11］Mili＇c S，Luli＇c D，Štimac D.Non-alcoholic fatty liver disease and obesity:biochemical，metabolic and clinical presentations［J］.World JGastroenterol，2014，20(28): 9330-9337.

［12］Ramos AN，de Oliveira Rocha B，de Almeida Rêgo VR，et al.The linkage between psoriasis and non-alcoholic fatty liver disease:a literature review［J］.Acta Dermatovenerol Croat，2014，22(2):132-136.

［13］Osumi T，Hashimoto T.Acyl-CoA oxidase of rat liver:a new enzyme for fatty acid oxidation［J］.Biochem Biophys Res Commun，1978，83(2):479-485.

［14］Aon MA，Bhatt N，Cortassa SC.Mitochondrial and cellularmechanisms formanaging lipid excess［J］.Front Physiol，2014，5:282.

［15］Lu HJ，Liou SS，Chang CJ，et al.Ruscogenin protects against high-fatdiet-induced nonalcoholic steatohepatitis in hamsters［J］.Planta Med，2014，80(11):870-879.

Ginsenoside Rg1 im proves liver function by regulating fat metabolism in rats w ith non-alcoholic fatty liver disease

PENG Xuan1，HUANG De-bin1，YAN Mi-ya1，PENG Shi-jun2
(1Medical School of HubeiMinzu University，2The Central Hospital of Enshi Autonomous Prefecture，Enshi445000，China.E-mail:5932347@qq.com)

R575.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.017

1000-4718(2015)05-0864-07

2014-10-27

2015-03-03

国家自然科学基金资助项目(No.81360654)

Tel:0718-8437479;E-mail:5932347@qq.com