巫翟，夏忠胜，钟娃，卢锡基，于涛，陈其奎(中山大学孙逸仙纪念医院消化内科，广东广州510120)

Wip1基因沉默对结肠癌细胞化疗敏感性的影响

巫翟，夏忠胜△，钟娃，卢锡基，于涛，陈其奎
(中山大学孙逸仙纪念医院消化内科，广东广州510120)

目的:观察靶向Wip1基因的特异性siRNA序列对结肠癌细胞Wip1基因的抑制效应，探讨Wip1基因沉默对结肠癌细胞化疗敏感性的影响。方法:将Wip1-811 siRNA转染入Wip1高表达的RKO结肠癌细胞株，采用real-time PCR法检测Wip1 mRNA的表达，采用Western blotting方法检测Wip1蛋白表达，采用MTS方法检测结肠癌细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期。结果:Wip1-811 siRNA明显抑制Wip1的表达。抑制Wip1基因表达后，转染组RKO结肠癌细胞对抗肿瘤药物的敏感性增加，5-氟尿嘧啶处理组RKO结肠癌细胞活力由(89.4±6.6)%降至(74.7±3.9)%(P＜0.05)，奥沙利铂处理组细胞活力由(77.9±2.4)%降至(66.7±2.9)% (P＜0.05)。转染Wip1-811 siRNA后，5-氟尿嘧啶处理组细胞凋亡比例由(7.7±0.5)%升至(12.3±3.2)% (P＜0.05);奥沙利铂处理组细胞凋亡比例由(14.7±2.1)%升至(34.0±2.1)%(P＜0.05)。结论:沉默Wip1基因表达能增强结肠癌细胞的化疗敏感性。

结肠癌;小干扰RNA;Wip1基因;化疗敏感性

［ABSTRACT］AIM:To observe the inhibitory effectof siRNA targeting to Wip1 gene on the Wip1 gene expression in the colon cancer cells and to investigate the influence of Wip1 gene silencing on the chemotherapy sensitivity of colon cancer cells.METHODS:Wip1-811 siRNA targeting to Wip1 genewas transfected into RKO colon cancer cellswith high expression of Wip1 gene.ThemRNA expression ofWip1 wasmeasured by real-time PCR.The protein level of Wip1 was detected by Western blotting.The viability of RKO colon cancer cellswasmeasured by MTSassay.The cell apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry.RESULTS:Wip1-811 siRNA efficiently inhibited the expression of Wip1 at mRNA and protein levels.The enhanced chemotherapy sensitivity of RKO colon cancer cellswas observed after inhibition of Wip1 gene expression.The viability of RKO colon cancer cellswas decreased from(89.4±6.6)%to(74.7±3.9)%after treated with 5-fluorouracil(P＜0.05)and decreased from(77.9±2.4)%to(66.7±2.9)%after treated with oxaliplatin(P＜0.05).The cell apoptotic rate was increased from(7.7±0.5)%to(12.3±3.2)%and from(14.7± 2.1)%to(34.0±2.1)%when RKO colon cancer cells were treated with 5-fluorouracil and oxaliplatin，respectively (P＜0.05).CONCLUSION:Wip1 gene silencing enhances chemotherapy sensitivity of colon cancer cells.

［KEY WORDS］Colon cancer;Small interfering RNA;Wip1 gene;Chemotherapy sensitivity

结肠癌是消化道常见肿瘤。在中国，近20年来，结肠癌的发病率不断上升。根据2013年统计资料，结肠癌的发病率已达29/100 000，仅次于肺癌及胃癌;死亡率近14/100 000，位居肿瘤死亡率排名第5位。结肠癌已成为越来越严重的影响社会健康的问题。大部分结肠癌患者就诊时已发展至中晚期，单纯外科治疗无法达到理想的治疗效果。外科手术后辅以化疗可以使结肠癌患者术后总的5年生存率提高10%～15%;对于肿瘤细胞全身转移无法手术的患者，化疗可以延长结肠癌患者的生存时间，并可使部分无法手术切除的病灶变为可手术治疗病灶。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)和奥沙利铂(oxali-platin)是治疗结肠癌最主要的2种一线药物，基于这2种药物的FOLFOX化疗方案被广泛采用，但其临床有效率只有50%，导致治疗失败的原因主要是结肠癌细胞对化疗药物产生了耐药性。以往的研究采用了各种方法来逆转结肠癌的耐药性，包括应用钙离子拮抗剂、反义寡核苷酸及针对耐药蛋白的siRNA［1］等，但这些方法疗效有限，且一些方法还存在不良反应。因此，仍有待寻找新的措施来逆转结肠癌细胞的多药耐药性。

Wip1是一种原癌基因，其编码的Wip1蛋白属于2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族。Wip1是一种单体酶，在2价阳离子(镁离子、锰离子)的催化下能直接使p53下游蛋白发生去磷酸化而失活，抑制p53介导的细胞DNA损伤修复及受损细胞的诱导凋亡等功能，从而促进肿瘤的发生。本研究通过RNA干扰技术，体外对RKO结肠癌细胞转染靶向Wip1基因的siRNA，探讨转染靶向Wip1基因的siRNA后，结肠癌细胞对化疗药的敏感性是否增强，从而有望为逆转结肠癌的耐药性提供一种新的方法。

材料和方法

1实验材料

人结肠癌细胞系RKO购自中国科学院上海生命科学研究院;胎牛血清购自BioInd;RPMI-1640培养基购自Gibco;小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)序列Wip1-811 siRNA及阴性对照序列由中国苏州吉玛公司合成;Opti-MEM®I无血清培养基和脂质体LipofectamineTM2000购自Life Technologies;RNAiso Plus、逆转录试剂盒和荧光预混试剂SYBR Premix Ex TaqTM(含SYBR Green荧光染料及PCR反应体系底物及酶)购自TaKaRa;PCR扩增引物由Takara合成。BCA蛋白浓度检测试剂盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂Cocktail和Western blotting制胶试剂购自北京康为世纪公司;兔抗人Wip1多克隆抗体购自GeneTex;兔抗人GAPDH单克隆抗体购自Bioworld Technology;山羊抗兔HRP-IgG购自Earth-Ox;ECL化学发光试剂盒购自Thermo;5-FU和奥沙利铂化疗药物购自中国大连美仑生物公司;MTS试剂盒购自Promega;流式细胞术实验用抗体购自BD。

2方法

2.1细胞培养RKO结肠癌细胞株常规培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中生长3 d后传代1次。取对数生长期细胞，分别按每孔1×104、5×104和2 ×105的标准接种培养于96孔、24孔和6孔板用于实验。

2.2siRNA的合成及转染根据NCBI数据库中Wip1基因序列(NCBI基因序列号8493)和siRNA设计原则，由苏州吉玛公司设计合成Wip1特异性siRNA链。siRNA序列(Wip1-811 siRNA)、阳性对照(GAPDH)siRNA及阴性对照siRNA序列由苏州吉玛公司合成。Wip1-811 siRNA的正义序列为5’-GGGUGGUUCUUGGAAUUCATT-3’，反义序列为5’-UGAAUUCCAAGAACCACCCTT-3’。采用LipofectamineTM2000进行siRNA转染，取对数生长期的RKO结肠癌细胞接种于24孔板，用不含抗生素的培养液培养24 h至细胞融合度达40%～50%后，弃去上清更换为Opti-MEM®I无血清培养基，Wip1-811 siRNA以50 nmol/L的浓度转染RKO细胞(转染率80%)，未做任何处理的细胞设为空白对照(control)组，用LipofectamineTM2000处理的细胞设为脂质体对照(liposome control)组，与人类基因无同源性序列的阴性siRNA序列处理组设为阴性对照(negative control)组，转染6 h后更换普通培养基。根据是否用相应浓度化疗药物处理，分为非药物组(non-drug group)及化疗药物组(chemotherapy drug group)。分组后细胞进行如下处理:(1)再培养24 h后提取细胞RNA，采用real-time PCR检测Wip1 mRNA的表达;(2)再培养48 h后收集细胞蛋白，采用Western blotting检测Wip1蛋白的表达;(3)再培养24 h后加入5-FU和奥沙利铂(终浓度均为5μmol/L)处理48 h，MTS检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期。

2.3Real-time PCR采用RNAiso Plus提取细胞总RNA，采用TaKaRa公司的逆转录试剂盒反转录成cDNA后，用Roche的LightCycler®480 Real-Time PCR扩增仪，于20μL反应体系中加入2μL的cDNA模板，0.4μL 10μmol/L的Wip1上游引物(5’-CAGGGAAACTTTACCAATGAA-3’)，0.4μL 10 μmol/L的Wip1下游引物(5’-ACGAACCAGGGCAGGTATAT-3’)，10μL SYBR Premix Ex TaqTM和7.2 μL的dH2O。采用18S rRNA作为内参照，18S rRNA上游引物为5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3’，下游引物为5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’。PCR反应条件为:95℃30 s;95℃5 s，60℃20 s，共40个循环;60℃15 s。Wip1和18S rRNA扩增片段长度分别为180 bp和112 bp。通过PCR扩增仪自带的基因相对表达量计算程序，计算各组Wip1 mRNA相对表达量，将阴性对照组Wip1 mRNA表达量设为1，通过与阴性对照组相比，比较各实验组目的基因的表达情况。

2.4Western blotting检测Wip1蛋白表达生长于6孔板的细胞去培养液，用冷PBS洗2次，每孔细胞加入裂解混合液100μL(91μL RIPA+9μL 10× cocktail)，置于冰上裂解30 min后，细胞刮刮净板底将裂解液移至干净EP管，超声细胞仪碎裂细胞后，14 000×g、4℃离心20min，取上清。采用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定细胞总蛋白浓度。取40μg细胞蛋白进行SDS-PAGE，5%浓缩胶70 V恒压电泳至分界线，10%分离胶100 V恒压电泳至胶底。200 mA 90 min恒流电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭90 min，4℃孵育I抗(Wip1 I抗1∶1 000稀释，GAPDH I抗1∶1 000稀释)过夜。次日TBST洗膜4次，每次10 min，加入II抗(羊抗兔HRP-IgG，1∶5 000稀释)室温孵育60 min，再用TBST洗膜4次，每次5 min，加入ECL发光液曝光显影。采用Image-Pro plus 6.0对Western条带进行灰度分析，Wip1蛋白条带灰度值除以相应内参条带灰度值得出各组Wip1蛋白的相对表达量并进行统计学分析。

2.5MTS法检测细胞活力对数生长期RKO细胞接种于96孔板，每孔细胞数为1×104，培养24 h后将Wip1-811 siRNA转入细胞并调整siRNA的终浓度为50 nmol/L，继续培养24 h后加入5-FU及奥沙利铂(终浓度均为5μmol/L)处理48 h，采用MTS法检测细胞活力。96孔板每孔细胞(含200μL培养基)加入20μL MTS试剂后，37℃、5%CO2培养箱中孵育3 h，室温振荡5 min，在酶标仪上读取570 nm波长的吸光度(A)值。实验共分为4组，未做任何处理的细胞设为空白对照组，用LipofectamineTM2000处理的设为脂质体对照组，与人类基因无同源性序列的siRNA序列处理组设为阴性对照组，转染Wip1-811 siRNA组设为转染组。其中每一组细胞中未加入化疗药物处理的细胞设为空白对照孔，其细胞活力记为1，通过与空白对照孔比较计算其余加入药物处理的细胞活力。

2.6流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期按前文所述处理好各组细胞后，用胰酶将细胞消化、重悬并转移至流式离心管，PBS洗2次后将细胞分为2管。一管用于检测细胞凋亡，加入5μL Annexin V及200μL 1×binding buffer缓冲液制成细胞数约1×109/L细胞悬液，避光反应30 min，加入10μL PI上机检测;另一管用于检测细胞周期，加入200μL PBS重悬细胞后用2 mL 70%冰冻乙醇固定细胞，次日处理后上机检测。

3统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析。计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，两组之间计量资料的比较采用t检验，多组之间计量资料的比较采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验，多重比较采用LSD-t检验或q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1Wip1-811 siRNA抑制结肠癌RKO细胞W ip1 mRNA和蛋白的表达

图1显示，空白对照组、脂质体对照组、阴性对照组之间Wip1的mRNA表达无明显差异，siRNA转染组Wip1的mRNA表达水平明显低于另外3组，转染组与阴性对照组相比，Wip1的mRNA表达量降低约4倍，差异显著(P＜0.05)。Western blotting结果显示，siRNA转染组Wip1蛋白表达水平明显低于另外3组，进一步灰度分析结果表明，Wip1-811 siRNA组蛋白的相对表达量较阴性对照组降低约4倍，差异显著(P＜0.05)，见图2。

Figure 2.Influence of Wip1-811 siRNA on the protein expression ofWip1 in RKO colon cancer cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs negative control.图2　Wip1-811 siRNA对RKO结肠癌细胞W ip1蛋白表达的影响

2Wip1-811 siRNA增强结肠癌RKO细胞对化疗药物的敏感性

表1显示，转染Wip1-811 siRNA不能抑制结肠癌RKO细胞的生长(P＞0.05)，空白对照组、脂质体对照组、阴性对照组及siRNA转染组中5-FU及奥沙利铂均能明显降低结肠癌RKO细胞生长活力，差异显著(P＜0.05);应用化疗药物后，与另外3组对比，转染组结肠癌RKO细胞生长活力下降更为显著(P＜0.05)，表明抑制Wip1基因表达后结肠癌RKO细胞对化疗药物的敏感性增加。

表1　转染W ip1-811 siRNA后用抗肿瘤药处理的RKO结肠癌细胞的活力Table 1.The viability of RKO colon cancer cells treated with antitumor drugs after transfection with Wip1-811 siRNA(%.Mean± SD.n=9)

3抑制Wip1基因表达增强化疗药物诱导的细胞凋亡

流式细胞术实验结果表明，转染Wip1-811 siRNA对细胞凋亡的影响与对照组相比差异无统计学意义;5-FU及奥沙利铂能诱导结肠癌RKO细胞凋亡，与对照组相比，差异显著(P＜0.05);应用化疗药物后，与阴性对照组相比，转染组凋亡细胞比例明显上升，差异显著(P＜0.05)，表明抑制Wip1基因表达能增强化疗药物诱导的细胞凋亡，见图3、4。

4Wip1基因表达水平对细胞周期的影响

流式细胞术细胞周期测定结果表明，转染Wip1-811 siRNA对细胞周期影响与对照组相比无统计学差异;5-FU阻滞结肠癌RKO细胞于G0/G1期，与对照组相比，G0/G1期细胞比例上升，S期相应降低，差异显著(P＜0.05);奥沙利铂将结肠癌RKO细胞阻滞于G2/M期，与对照组相比，G2/M期细胞比例上升，差异显著(P＜0.05)，沉默Wip1基因表达后，细胞周期比例无明显改变(P＞0.05)，表明Wip1基因表达不影响5-FU及奥沙利铂诱导的细胞周期改变，见图5、6和表2。

讨论

p53在众多的抑癌基因中是最重要的抑癌基因，p53的突变和功能灭活发生于半数以上的人类肿瘤中，完整的p53是阻止癌症进展的关键。Wip1是抑制p53功能的主要因子，目前已经发现Wip1能直接或间接使包括p53、p38 MAPK、ATM、CHK1、CHK2、MDM2和UNG2在内的至少7种靶蛋白去磷酸化［2-3］，引起P53蛋白降解。新研究报道诱导Wip1高表达可以抑制p16基因［4］，导致细胞恶性增殖，Wip1已成为促进肿瘤发生、发展的重要因素。

Figure 3.Influence ofWip1-811 siRNA on the apoptosis of RKO colon cancer cells treated with 5-FU.Mean±SD.n=6.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs negative control+5-FU.图3　转染W ip1-811 siRNA对5-氟尿嘧啶诱导的RKO结肠癌细胞凋亡的影响

Figure 4.Influence ofWip1-811 siRNA on the apoptosis of RKO colon cancer cells treated with oxaliplatin.Mean±SD.n=6.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs negative control+oxaliplatin.图4　转染W ip1-811 siRNA对奥沙利铂诱导的RKO结肠癌细胞凋亡的影响

Figure 5.Influence ofWip1-811 siRNA on the cell cycle of RKO colon cancer cells treated with 5-FU.图5　转染W ip1-811 siRNA对5-氟尿嘧啶诱导的RKO结肠癌细胞周期的影响

Figure 6.Influence ofWip1-811 siRNA on the cell cycle of RKO colon cancer cells treated with oxaliplatin.图6　转染W ip1-811 siRNA对奥沙利铂诱导的RKO结肠癌细胞周期的影响

结肠癌组织存在Wip1基因高表达，Wip1表达水平与淋巴结转移、Dukes分级相关，高表达水平Wip1基因提示较差的预后［5］。为进一步明确Wip1在结肠癌中的作用，本研究设计靶向Wip1基因的siRNA并导入RKO结肠癌细胞，转染后转染组RKO细胞Wip1 mRNA及蛋白表达均较另外3组明显降低，证明Wip1-811 siRNA能有效抑制Wip1基因表达。进一步实验表明，转染Wip1-811 siRNA对RKO细胞增殖、凋亡及细胞周期无明显影响，而在应用相同浓度化疗药物的情况下，转染组RKO细胞的细胞活力明显低于另外3组，细胞凋亡比例较对照组显著增加，细胞周期无明显变化，提示低表达水平的Wip1基因能增强化疗药物的细胞毒作用，抑制Wip1基因表达能增强结肠癌细胞RKO的化疗敏感性。本研究证实了Wip1与结肠癌细胞化疗敏感性相关，但Wip1在其它结肠癌细胞株中是否表现出相同作用及具体作用机制有待进一步研究。部分研究者认为下调Wip1基因表达可提高p53水平并直接诱导细胞凋亡，基于5-FU和奥沙利铂方案的结肠癌化疗患者，高表达水平的p53可以提高化疗成功率，从而延长患者存活时间［6］;抑制Wip1基因能增加野生型P53蛋白的积聚，引起细胞周期蛋白D1表达增加，使S期细胞比例上升，从而提高细胞对化疗药物的敏感性［7］。但本研究结果表明抑制Wip1基因本身不能引起RKO结肠癌细胞凋亡增加及细胞周期改变，仍需要从其它方面探讨Wip1影响化疗敏感性的可能。有研究认为Wip1基因主要在细胞应对外界刺激如损伤、炎症、射线及药物等过程中起作用，通过对磷酸化的p38 MAPK通路去磷酸化导致相关信号通路的失衡，细胞凋亡和细胞周期进程被阻滞，降低药物治疗效果［8］。也有研究认为Wip1是死亡相关蛋白6磷酸化关键的负反馈因素之一，高表达Wip1能抑制DNA损伤诱导的死亡相关蛋白6磷酸化，阻止细胞凋亡发生，从而增加细胞对刺激耐受性［9］。沉默Wip1基因可能对肿瘤干细胞自我增殖存在一定抑制作用，从而参与调节肿瘤细胞的化疗敏感性［10］。

表2　转染W ip1-811 siRNA后用抗肿瘤药处理的RKO结肠癌细胞的细胞周期分析Table 2.The cell cycle analysis of RKO colon cancer cells treated with antitumor drugs after transfection with Wip1-811 siRNA(%.Mean±SD.n=6)

本研究采用siRNA瞬时转染方法成功沉默Wip1基因并证实低表达水平的Wip1增强RKO结肠癌细胞的化疗敏感性，为解决结肠癌化疗耐药性提供了新的方法。然而，siRNA瞬时转染存在基因抑制强度不理想、有效作用持续时间较短等不足之处，对实验结果的判读造成一定影响。本研究结果均由体外实验观察得到，未来需要构建Wip1-811 siRNA稳定表达载体，在体内外观察Wip1-811 siRNA长期稳定的RNA干扰效应，并进一步探讨Wip1参与调节肿瘤细胞化疗敏感性的相关机制。

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Effect of Wip1 gene silencing on chemotherapy sensitivity of human colon cancer cells

WU Di，XIA Zhong-sheng，ZHONGWa，LU Xi-ji，YU Tao，CHEN Qi-kui
(Department of Gastroenterology，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China.E-mail:xiazhsh@163.com)

R543.1;R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.016

1000-4718(2015)05-0857-07

2015-02-09［修回日期］2015-04-07

Tel:020-81332598;E-mail:xiazhsh@163.com