胡阳，杨杰，余汝媛，汪洋(暨南大学生命科学技术学院，功能蛋白质研究广东普通高校重点实验室，广东广州510632)

磷酸化蛋白质组学鉴定PTPLAD1调控的结肠癌细胞酪氨酸磷酸化蛋白质*

胡阳，杨杰，余汝媛，汪洋△
(暨南大学生命科学技术学院，功能蛋白质研究广东普通高校重点实验室，广东广州510632)

目的:用磷酸化蛋白质组学的方法鉴定并分析结肠癌细胞中含蛋白酪氨酸磷酸酶样A结构域蛋白1(PTPLAD1)调控的酪氨酸磷酸化蛋白。方法:运用siRNA技术沉默PTPLAD1的表达，于细胞培养条件下运用氨基酸稳定同位素标记技术(stable lsotope labelingwith amino acids in cell culture，SILAC)标记细胞，用酪氨酸磷酸化抗体免疫沉淀富集酪氨酸磷酸化蛋白，用LTQ-OrbitrapXL质谱鉴定因敲低PTPLAD1所出现的差异表达的酪氨酸磷酸化蛋白，进一步利用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件对这些差异蛋白进行生物信息学分析。结果:用real-time PCR筛选得到有效的siRNA干扰片段，Western blot验证其干扰效果及有效干扰时间。质谱鉴定PTPLAD1调控的差异酪氨酸磷酸化蛋白共20个，其中显著上调的8个，显著下调的10个，主要为转录因子及肿瘤标志物相关蛋白。IPA软件的结果表明PTPLAD1调控的差异酪氨酸磷酸化蛋白的功能主要与器官发育分化、维持组织分化类型及细胞凋亡、增殖相关。结论:成功鉴定出PTPLAD1调控的差异酪氨酸磷酸化蛋白，可以为后续研究PTPLAD1在结肠癌的发生发展中的作用及机理提供基础。

含蛋白酪氨酸磷酸酶样A结构域蛋白1;HCT-116细胞;小干扰RNA;氨基酸稳定同位素标记技术;磷酸化蛋白质组学

［ABSTRACT］AIM:To identify and analyze tyrosine-phosphorylated proteins regulated by protein tyrosine phosphatase-like A domain containing protein 1(PTPLAD1)in colon cancer cells by phosphoproteomics.METHODS:The expression of PTPLAD1 in colon cancer cell line HCT-116 was knocked down by small interfering RNAs，and the differential expression of tyrosine-phosphorylated proteins in response to the konckdown of PTPLAD1 in HCT-116 cellswas identified by stable isotope labeling with amino acid in cell culture(SILAC)，coupled with the tyrosine phosphorylation antibody immunoprecipitation and LC-MS/MSanalysis.The Ingenuity Pathway Analysis(IPA)softwarewas employed for bioinformatics analysis on the differentially-expressed proteins.RESULTS:A total of20 differentially-expressed tyrosine-phosphorylated proteins were identified by MS，including 8 markedly up-regulated and 10 evidently down-regulated proteins.IPA software suggested that these proteinsweremainly associated with the disease of cancer，tissue development and function，and cell death and survival.CONCLUSION:We successfully identified PTPLAD1-regulated differentially-expressed tyrosinephosphorylated proteins in colon cancer cell line HCT-116.Our analysis suggests that PTPLAD1-regulated proteins in colon cancer are closely correlated with colon cancer.

［KEY WORDS］Protein tyrosine phosphatase-like A domain containing protein 1;HCT-116 cells;Small interfering RNA;Stable isotope labeling with amino acid;Phosphoproteomics

肠癌在全球发病率高居第三，在消化道类肿瘤中的发病率仅次于胃癌。到目前为止，已知的致癌基因中有3/4是酪氨酸激酶介导的，因而更多的关注投向了对酪氨酸激酶的研究［1］。人类中已经研究较为清楚的编码蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)家族的基因有107个，它们在调控细胞生理和病理进程的许多方面发挥重要作用，而且具有一些重要的结构特征，如特征序列(H/V)C (X)5R(S/T)组成的活性部位和外部常见环状结构，是它们发挥催化作用的重要结构基础［2］。

含蛋白酪氨酸磷酸酶样A结构域蛋白1(protein tyrosine phosphatase-like A domain containing protein 1，PTPLAD1)是属HACD极长链脂肪酸脱水蛋白家族成员，在哺乳类动物体内3-羟酰辅酶A氧化还原酶有4种同工酶，PTPLAD1(HACD3)分子即为其中的1种［3］。由于PTPLAD1含有与PTPs标志性催化活性位点非常类似的氨基酸序列(H/V)C(X)5R(S/ T)，它可能与PTPs具有相似的信号调节功能。目前关于PTPLAD1在机体中的作用报道较少，主要集中在红细胞分化及丙型肝炎病毒复制方面［4-5］，我们前期的实验结果表明PTPLAD1在结肠癌中是低表达的。为了进一步研究其分子机理，我们用蛋白质组学分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，即所谓磷酸化蛋白质组学［6-7］。本研究通过siRNA技术沉默PTPLAD1的表达，利用细胞培养条件下的氨基酸稳定同位素标记(stable isotope labelingwith amino acid in cell culture，SILAC)定量蛋白质组学结合免疫共沉淀富集技术，鉴定了PTPLAD1差异调控的酪氨酸磷酸化蛋白及这些蛋白磷酸化位点，进一步对这些差异酪氨酸磷酸化蛋白进行生物信息学分析，从而揭示PTPLAD1在结肠癌细胞HCT-116中调控酪氨酸磷酸化蛋白变化的情况，并分析其参与的信号通路。

材料和方法

1主要试剂

人结肠腺癌细胞系HCT-116购自中国科学院上海细胞库;siRNA干扰片段合成购自GenePharma;转染试剂Lipofectamine iMAX购自Invitrogen;胎牛血清和基本细胞液体培养基和胎牛血清购自Gibco; TRIzol®Reagent购自Life Technologies;逆转录试剂购自TaKaRa;BCA法蛋白浓度测定试剂盒和SILAC试剂盒为Pierce产品;IP裂解液和RIPA裂解液(强)购自碧云天公司;磷酸酶和蛋白酶抑制剂(Cocktail)购自Roche;PTPLAD1鼠单抗购自Abcam;Phospho-Tyrosine鼠单抗购自Cell Signaling;Protein A/G PLUS-Agarose购自Santa Cruz;actin抗体和胰蛋白酶为Promega产品;引物由Invitrogen设计合成，见表1。

表1　Real-time PCR引物序列Table 1 Sequences of real-time PCR primers

2主要仪器

倒置显微镜(Nikon);蛋白电转仪和real-time PCR仪为Bio-Rad产品;酶标仪(BioTek);流式细胞仪(Becton Dickinson);LTQ Orbitrap XL组合式质谱(Thermo);CO2细胞培养箱(Heal Force);超净工作台为江苏苏净安泰公司产品;小型高速冷冻离心机(Eppendorf);纯水系统(Millipore)。

3主要方法

3.1细胞培养、PTPLAD1序列同源性比对及其干扰片段设计将结肠癌HCT-116细胞接种于6孔板中，用含有10%胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养基，置于5%CO2、37℃、100%湿度的细胞培养箱中培养。将PTPLAD1蛋白进行NCBIBLAST在线同源序列比对分析，PTPLAD1 siRNA序列根据GenScript公司网上设计系统进行设计，由苏州吉玛生物公司合成了3对PTPLAD1基因的干扰片段，见表2。

表2　si-PTPLAD1干扰片段序列Table 2.Sequences of si-PTPLAD1

3.2RNAi沉默PTPLAD1基因表达

3.2.1流式细胞术检测干扰效率待细胞处于对数生长期时，用Lipofectamine iMAX脂质体，分别转染si-PTPLAD1(3对)、荧光标记si-FAM和阴性对照(negative control，NC)siRNA(si-NC)，转染24 h后，倒置荧光显微镜下观察si-FAM转染情况，并分别收集荧光标记的si-FAM和si-NC组细胞，通过C6 Flow Cytometer System检测siRNA的转染效率。

3.2.2Real-time PCR筛选PTPLAD1有效干扰片段将这3种干扰片段转染到HCT-116细胞，24～48 h后提取细胞总RNA反转录为cDNA，real-time PCR检测3种干扰片段的干扰效果。

3.2.3Western blot确定有效干扰时间在HCT-116中转染有效的si-PTPLAD1片段，0 h、24 h、48 h和72 h后，收取不同时点的细胞，提取总蛋白，用BCA法测蛋白浓度定量后，加入5×SDS凝胶加样缓冲液，沸水煮5 min，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后，将膜与Ⅰ抗(鼠抗人PTPLAD1抗体1∶1 000稀释)4℃孵育过夜，PBST洗膜，再与兔抗鼠HRPⅡ抗在室温下孵育1 h，PBST洗膜，将膜与ECL发光底物结合，曝光，显影。

3.3酪氨酸磷酸化蛋白的富集及其定量蛋白组学

3.3.1SILAC标记HCT-116细胞将50 mg［13C6］L-lysine-2HCl(重)和50 mg L-arginine-HCl(轻)彻底溶解于1 mL培养基。将溶解的氨基酸加入到含10%胎牛血清的500 mL培养基，加入青霉素和链霉素至终浓度100 mg/L，彻底混合均匀，用0.22μm的滤膜过滤除菌，在瓶上标记“重”。重复上述步骤再配制轻链标记的培养基。配制好的SILAC培养基4℃避光保存，并于6个月内使用。用SILAC培养基对HCT-116进行稳定同位素标记HCT-116(heavy)和HCT-116(light)，标记完全后(7代)取对数生长期细胞进行实验。

3.3.2免疫共沉淀富集酪氨酸磷酸化蛋白及定量蛋白质组学实验组si-PTPLAD1干扰重链标记的HCT-116(heavy)，对照组si-NC干扰轻链标记的HCT-116(light)，24 h后用胰酶消化收集细胞，用IP裂解液分别裂解实验组及对照组细胞，BCA法测蛋白浓度，轻重链蛋白进行等量混合后，用鼠IgG及琼脂糖珠子洗蛋白裂解液去除非特异结合蛋白，加入抗酪氨酸磷酸化抗体4℃旋转孵育过夜，再加入琼脂糖珠子4℃孵育4 h，洗珠子去除非特异性结合蛋白，行SDS-PAGE，银染，将银染条带进行切割分成40等份，脱色，蛋白质还原烷基化，胰蛋白酶胶内酶解，肽段萃取、冻干，然后多肽通过液相色谱偶联LTQ-Orbitrap XL分析，质谱数据经Max Quant软件处理得到差异蛋白，Ingenity Pathway Analysis(IPA)软件对差异蛋白数据进行生物信息学分析。

4统计学处理

用SPSS 16.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异(LSD)法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1PTPLAD1蛋白结构及功能分析

在之前的研究中，我们发现PTPLAD1在结肠癌中是低表达的，为了进一步揭示该蛋白的功能，我们首先通过NCBIBLAST对PTPLAD1蛋白362个氨基酸序列进行同源比对分析，发现PTPLAD1主要含有2个结构域，如图1所示，前1～125个氨基酸具有与p23相似的结构域，而p23是作为HSP90的辅助分子伴侣发挥功能的，对细胞内的调控因子和信号蛋白具有调控作用。后196～362结构域属于PTPLA超家族，而PTPLA蛋白家族含有典型的PTPs标志性催化活性位点(H/V)C(X)5R(S/T)。PTPLA主要参与发育、分化及维持组织分化类型，于是我们推测PTPLAD1具有PTPs的功能，并且可能在肿瘤发生中扮演着重要的角色。

Figure 1.Structure and functional domains of PTPLAD1.The former region of PTPLAD1 is homologouswith p23，and its latter region belongs to PTPLA superfamily.图1　PTPLAD1蛋白结构及功能分析

2RNAi沉默PTPLAD1基因表达

为进一步研究PTPLAD1在肿瘤中的抑制作用，我们运用RNA干扰技术，在结肠癌细胞HCT-116中敲低PTPLAD1来探索细胞的磷酸化蛋白变化情况。首先我们用倒置荧光显微镜观察到si-FAM成功转染到HCT-116细胞中，细胞发绿色荧光，流式细胞术检测细胞转染siRNA(si-FAM)的效率达90%以上。Real-time PCR筛选有效的si-PTPLAD1，发现编号为418和1045这2种干扰片段效果较好，Western blot实验表明成功干扰PTPLAD1基因的表达及在24 h干扰效果较好，见图2。

Figure 2.PTPLAD1 knockdown by siRNA in HCT-116 cell line.A:carboxyfluorescein-labelled siRNA(si-FAM)in the transfected cancer cells were observed under inverted fluorescent contrast-phasemicroscope(×200);B:the efficiency of RNA interference in colon cancer cellswas detected by flow cytometry;C:the effectiveness of the interference fragments of PTPLAD1 (si-418，si-710 and si-1045)was evaluated;D:Western blot analysis of PTPLDA1 in HCT-116 cells after knockdown of PTPLAD1 by siRNA.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs si-NC group.图2　结肠癌细胞HCT-116中siRNA高效沉默PTPLAD1基因表达

3免疫共沉淀富集酪氨酸磷酸化蛋白及定量蛋白质组学研究PTPLAD1调控的磷酸化组学变化

PTPLAD1具有典型的PTPs结构域，其变化必然引起细胞内部磷酸化蛋白的变化，为研究该蛋白所调控的磷酸化蛋白的变化情况，我们在用SILAC标记的结肠癌细胞中敲低PTPLAD1，并运用免疫共沉淀的方法富集酪氨酸磷酸化蛋白，通过质谱共鉴定出有定量信息的蛋白质20个，表达差异倍数(heavy/ light)大于2或小于0.5的蛋白质共18个，其中在HCT-116细胞中上调8个，下调10个(图3)，相应这些差异蛋白鉴定到的差异磷酸化位点见表3。利用IPA软件对这些差异蛋白质进行分析，得出2条分值较高的相关细胞网络通路，主要与器官发育分化、维持组织分化类型及与细胞凋亡增殖相关(图4)。进一步对这些蛋白质作功能聚类分析，与肿瘤疾病相关的蛋白质18个，与细胞生存及死亡相关的蛋白质8个，与细胞形态、细胞组装及信号转导相关的蛋白质各6个，与胚胎发育及组织分化相关蛋白各5个。从对差异蛋白质的功能分类结果表明，PTPLAD1在结肠癌细胞调控的磷酸化蛋白主要影响细胞形态、组装及组织分化与发育等方面。其中鉴定到许多转录因子及肿瘤标志物相关蛋白，如E2F8和CA125，分别在HCT-116细胞中上调0.2倍和17.7倍，见表4。

Figure 3.SILAC-IP quantitative proteomics to identify PTPLAD1-regulated phosphorylated proteins in colon cancer cell line HCT-116.A:theworkflow of the SILAC-based quantitative proteomics coupled with immunoprecipitation;B:differential ratio of the phosphorylated proteins regulated by PTPLAD1.图3　SILAC定量蛋白质组学结合酪氨酸免疫共沉淀技术鉴定PTPLAD1在结肠癌细胞HCT-116中所调控的磷酸化蛋白

讨论

有研究证实，结肠癌的发生是一个多原因参与、多阶段发展、多步骤积累、多基因改变的疾病，涉及到多种癌基因的扩增和高表达，以及抑癌基因的失活等［1］。我们对PTPLAD1的蛋白序列及结构进行同源比对发现，PTPLAD1含有与酪氨酸磷酸酶PTP标志性催化活性位点非常类似的氨基酸序列(H/V) C(X)5R(S/T)。多项研究表明PTPs在细胞信号转导过程中发挥着重要的作用，一些人类疾病如某些癌症、糖尿病、白血病、免疫缺陷病、诺南氏综合症等正是由PTPs的基因突变或异常表达造成的［8］。尽管PTPLAD1蛋白含有类似PTPs，对于它是否在肿瘤细胞信号转导过程中发挥功能未见报道。

PTPLAD1(HACD3)是用丁酸钠处理成纤维细胞时被鉴定到的，丁酸钠通常被用来抑制细胞的增殖并诱导其分化。研究人员称PTPLAD1与激活的Rac1形成复合物，可能参与组成Rac1信号通路并对基因的表达起调控作用［5］。有研究报道，该家族另一蛋白成员PTPLAD2在人食管鳞状细胞癌中的表达低于其在正常食管鳞状上皮中的表达。PTPLAD2在癌组织浸润广泛、肿瘤细胞分化较低及伴有淋巴结癌转移的病例中表达较低，PTPLAD2可能是食管癌发生及进展中的抑癌基因［9-10］。PTPLAD1与PTPLAD2同属于HACD家族成员，具有重要的序列相似性，这提示PTPLAD1可能与肿瘤的发生有一定的相关性。

本研究通过免疫共沉淀结合SILAC定量蛋白质组学技术，分析了PTPLAD1对结肠癌细胞HCT-116蛋白磷酸化水平的影响。在敲低PTPLAD1的情况下，用抗酪氨酸磷酸化的抗体成功富集了酪氨酸磷酸化的蛋白质并结合LTQ-Orbitrap XL质谱鉴定了PTPLAD1差异表达所调控的酪氨酸磷酸化蛋白及这些蛋白磷酸化位点，进一步利用IPA软件对这些差异酪氨酸磷酸化蛋白进行生物信息学分析［11］。

表3　PTPLAD1所调控蛋白的磷酸化位点Table 3.The phosphorylation sites of PTPLAD1-regulated proteins

Figure 4.The functional signaling networks associated with PTPLAD1 by IPA analysis.A:PTPLAD1-related functional signaling network 1 mainly involved in organmorphology，skeletal and muscular system development and function，and cellular compromise;B:network 2 mainly involved in cell death and survival，gene expression，and cellular growth and proliferation.图4　IPA软件分析PTPLAD1及其调控的磷酸化相关蛋白

从分析结果中，我们发现与肿瘤疾病相关的蛋白质18个，与细胞生存及死亡相关的蛋白质8个，与细胞形态、细胞组装及信号转导相关的蛋白质各6个。从对差异蛋白质的功能分类结果表明，PTPLAD1对结肠癌细胞磷酸化的调控，主要体现在影响细胞形态、组装及组织分化与发育等方面。其中有许多转录因子及肿瘤标志物相关蛋白，如E2F8和CA125，也受到了PTPLAD1差异表达的影响。

本研究运用RNAi技术结合高通量磷酸化蛋白质组学技术，对PTPLAD1调控的差异酪氨酸磷酸化蛋白做出了初步探索。在对PTPLAD1所调控的差异酪氨酸磷酸化蛋白进行的功能蛋白组学分析中，我们鉴定出了多个在结肠癌细胞中酪氨酸磷酸化异常增高和降低的蛋白。生物信息学分析表明PTPLAD1调控的差异酪氨酸磷酸化蛋白主要是与癌症、血液系统疾病及免疫性疾病相关，并参与器官发育分化、维持组织分化类型及细胞凋亡增殖相关通路。这些结果为进一步研究PTPLAD1在结肠癌发生发展中的分子机理提供了线索。

表4　PTPLAD1涉及到的主要疾病及生物学功能Table 4.Diseases and biofunctions involved by PTPLAD1

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Phosphoproteom ics to analyze PTPLAD1-regulated tyrosine-phosphorylated proteins in colon cancer cells

HU Yang，YANG Jie，YU Ru-yuan，WANG Yang
(Key Laboratory of Functional Protein Research ofGuangdong Higher Education Institutes，Collegeof Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail:wangyang8857@gmail.com)

R329.2+1;R730.23

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.014

1000-4718(2015)05-0845-07

2014-12-31［修回日期］2015-03-02

国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(No.2011CB910700)

Tel:020-85227039;E-mail:wangyang8857@gmail.com