梁孟亚，唐志贤，陈光献，荣健，戴刚，吴钟凯(中山大学附属第一医院心脏外科，广东广州510080)

深低温停循环下幼猪脑皮质HIF-1与NGB的表达及作用*

梁孟亚，唐志贤，陈光献，荣健，戴刚，吴钟凯△
(中山大学附属第一医院心脏外科，广东广州510080)

目的:观察深低温停循环(DHCA)下幼猪脑皮质缺氧诱导因子1(HIF-1)与神经珠蛋白(NGB)的表达变化。方法:五指山猪共15头随机分成体外循环组(CPB组)、深低温停循环组(DHCA组)与深低温停循环选择性顺行脑灌注组(SACP组)。建立体外循环后，DHCA组降温至18℃后停循环40 min，SACP组停循环后经无名动脉顺行脑灌注40 min。复灌180 min后取脑皮质组织行HE染色镜检，Western blot及real-time PCR检测HIF-1α、NGB蛋白表达及mRNA水平。结果:HE染色显示与DHCA组相比SACP组脑组织损伤显著减轻。复灌180 min后DHCA组及SACP组脑皮质中HIF-1α的蛋白及mRNA水平均显著高于CPB组(P＜0.05)，同时SACP组动物脑组织HIF-1α的蛋白及mRNA水平显著高于DHCA组(P＜0.05)。复灌180min后DHCA组及SACP组脑皮质中NGB的蛋白及mRNA水平均显著高于CPB组(P＜0.05)，同时SACP组动物脑组织NGB的蛋白及mRNA水平显著高于DHCA组(P＜0.05)。结论:HIF-1与NGB的表达上调参与了脑组织对DHCA脑损伤的反应机制，并可能是SACP脑保护作用的机制之一。

深低温停循环;选择性顺行脑灌注;缺氧诱导因子1;神经珠蛋白

［ABSTRACT］AIM:To observe the expression of hypoxia-inducible factor1(HIF-1)and neuroglobin(NGB)in piglet cortex during deep hypothermic circulatory arrest.METHODS:Wuzhishan piglets were random ly assigned to cardiopulmonary bypass group(CPB group)，40 min of circulatory arrest(CA)at18℃without cerebral perfusion(DHCA group)or with selective antegrade cerebral perfusion(SACP group).After180min of reperfusion，cortical tissuewas harvested for determining HIF-1αand NGB expression by HE staining，Western blotand real-time PCR.RESULTS:Severer cerebral injury was observed in DHCA group than that in SACP group.After 180 min of reperfusion，HIF-1αprotein and mRNA levelswere significantly higher in DHCA group than those in CPB group(P＜0.05).Accordingly，SACP animal had higher levels of HIF-1αprotein andmRNA than those in DHCA group(P＜0.05).Simultaneously，higher NGB protein and mRNA levels were found in DHCA group than those in CPB group after 180 min of reperfusion(P＜0.05).The SACP animal had higher levels of NGB protein and mRNA than those in DHCA group(P＜0.05).CONCLUSION:Upregulation of HIF-1 and NGB are involved in themechanism against cerebral injury resulting from DHCA in the cortex and possibly a part of cerebral protective effect of SACP.

［KEY WORDS］Deep hypothermic circulatory arrest;Selective antegrade cerebral perfusion;Hypoxia-inducible factor 1;Neuroglobin

深低温停循环(deep hypothermic circulatory arrest，DHCA)目前广泛用于主动脉弓手术及复杂先天性心脏病矫治手术，但术后出现的神经系统损害是主要并发症。DHCA导致的脑损伤目前机制尚未十分明确［1］。近年的研究发现缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)通路在脑缺血损伤中扮演重要角色［2］，然而DHCA过程中HIF-1的表达情况尚未有文献报道。神经珠蛋白(neuroglobin，NGB)是新近发现的一类主要存在于神经系统的高氧亲和力珠蛋白，其在脑卒中的角色越来越受到重视，有研究发现缺氧条件下HIF-1可调控NGB的表达，提示两者间存在功能联系，目前HIF-1及NGB是否参与脑组织对DHCA脑损伤的反应机制未有研究涉及。近年来应用选择性顺行脑灌注(selective antegrade cerebral perfusion，SACP)在减轻DHCA导致的术后脑损伤方面取得较好的疗效，其脑保护机制部分可能与提高脑组织对缺氧应激的应答能力相关［3］。HIF-1及NGB是脑组织应对缺氧损伤的重要应答因子，而目前尚未有研究分析两者在SACP中的表达改变。本研究旨在通过建立幼猪DHCA模型观察HIF-1及NGB在DHCA动物脑皮质的中的表达变化，并探讨其在SACP脑保护机制中的作用。

材料和方法

1动物、药品、试剂和仪器

健康雄性2～4月龄五指山小型香猪15头，体重(11.27±2.70)kg，由广州白云实验动物研究所提供。

HIF-1和NGB抗体购自Abcam;Trizol购自Invitrogen;HRP标记Ⅱ抗(HRP2025)购自Forevergen; ReverTra Ace qPCR试剂盒购自Toyobo Biochemicals;SsoFast EvaGreen Supermix试剂盒购自Bio-Rad。

体外循环管道及膜肺(Medtronic);人工心肺机(Stoker);变温水箱(Sarns);多导生理记录仪(BIOPAC);动物麻醉呼吸机(Bird Vela);自动取样枪(Bard MAGNUM);紫外凝胶分析系统(Bio-Rad); TC-200型PCR仪(MJReseareh)。

2方法

2.1实验动物分组五指山小型香猪共15头按照随机原则分为3组，每组5只:(1)体外循环组(CPB组):动物经历40 min并行体外循环作为对照组;(2)深低温停循环无脑灌注组(DHCA组):动物接受18℃单纯深低温停循环40 min;(3)深低温停循环选择性顺行脑灌注组(SACP组):动物接受18℃深低温停循环40 min，同时经无名动脉行顺行脑灌注。

2.2深低温停循环与逆行脑灌注操作实验动物由静脉注射芬太尼2μg/kg，维库溴铵0.1 mg/kg诱导后行气管插管。以七氟醚吸入，芬太尼及维库溴铵静脉注射维持麻醉。股动、静脉分别置管并连接多导生理记录仪监测平均动脉压及中心静脉压。手术操作与体外循环流程均模拟临床心脏手术过程。胸骨正中切口，右心房内注射肝素3 mg/kg肝素化后，主动脉和上、下腔静脉分别插入10F主动脉插管和2条12F静脉插管，并连接人工心肺机。体外循环管道及膜肺使用乳酸林格液预充。灌流流量维持于75～80 mL·kg－1·min－1，平均动脉压维持于50～80 mmHg之间。体外循环开始后，逐渐降温直至鼻咽温18℃。CPB组不进行降温，阻断主动脉后顺行灌注心肌停跳液致心脏停跳，体外循环转流40 min后开放主动脉。DHCA组动物鼻咽温降至目标温度后开始停循环40 min。SACP组于停循环开始后经右无名动脉按20 mL·kg－1·min－1流量顺行灌注，其余主动脉弓血管以套索收紧阻断，灌注压力维持于45～50 mmHg。停循环40 min后，开放主动脉恢复流量复温直至鼻咽温达到36℃。复灌180 min后处死实验动物，开颅后留取脑皮质组织，置于2.5%戊二醛及0.1 mmol/L甲次砷酸盐混合溶液中固定并于4℃冷冻保存，或于－70℃低温冰箱保存备下一步检测。

2.3脑皮质组织HE染色脑皮质组织以10%甲醛固定24 h后经梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片后经苏木素伊红染色，置于光学显微镜下观察。

2.4Western blot测定脑皮质HIF-1α和NGB蛋白表达取100 mg脑皮质组织，剪碎后加入300μL RIPA裂解液进行匀浆，4℃、16 000×g离心30 min，收集中层蛋白液体。采用Bradford进行蛋白定量。所使用SDS凝胶浓度为12%。电泳前，100℃沸煮蛋白样本5 min，使蛋白变性。电泳条件为恒压200 V 45 min。转膜条件为恒压200 V 60 min。封闭液(5%脱脂奶粉溶于TBST)封闭1 h。4℃摇晃孵育HIF-1Ⅰ抗(1∶1 000)和NGBⅠ抗(1∶1 000)过夜。采用HRP标记Ⅱ抗(1∶3 000)常温孵育1 min。TBST缓冲液室温下摇床摇动洗膜3次。ECL发光液化学发光法显色。结果图片使用Image J软件测定灰度值。以GAPDH(1∶5 000)作为内参照，比较不同处理后上述蛋白表达的差异。

2.5脑皮质HIF-1α和NGBmRNA的real-time PCR检测取脑皮质组织加入Trizol液中根据操作规程进行总RNA提取，然后应用ReverTra Ace qPCR试剂盒进行反转录，引物如下:HIF-1的上游引物为5’-GCTACAACATCACCATACAG-3’，下游引物为5’-GCGACAGATAACACATTAGG-3’;NGB的上游引物为5’-CCCTCTTCCAGTACAACT-3’，下游引物为5’-CAATCACAAGCATCACCTT-3’;β-actin的上游引物为5’-TGTTGACAATGGATCCGGTA-3’，下游引物为5’-CTGCTGGAAGGTGGAGAGAG-3’。应用SsoFast EvaGreen Supermix试剂盒进行cDNA扩增，实验体系如下:SsoFast EvaGreen Supermix 10μL;模板DNA 2μL;引物0.4μmol/L。扩增参数为98℃2 min; 98℃5 s，57℃30 s，共40个循环。产物凝胶电泳后用图像分析系统进行数据分析。

3统计学处理

使用SPSS 20.0软件进行统计分析。连续指标数据以均数±标准差(mean±SD)表示。采用单因素方差分析检验组间均数差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1脑皮质HE染色

动物脑皮质HE染色结果显示，CPB组动物脑皮质毛细血管扩张充血明显，组织结构基本正常。DHCA组皮质神经元排列紊乱，细胞皱缩，染色质结紧及胞浆浓缩明显，细胞周围有空泡形成，局部液化性坏死。多数小血管明显充血，周围淋巴细胞围绕呈“袖套”样。SACP组脑皮质结构基本正常，组织轻度水肿，部分血管扩张充血，炎症细胞浸润不明显，其组织结构损伤程度较DHCA组显著减轻，见图1。

Figure 1.The histopathological changes of the frontal cortex(HE staining，×400).图1　脑皮质HE染色结果

2脑皮质HIF-1α及NGB蛋白表达结果

复灌180 min后DHCA组及SACP组HIF-1α的表达均显著高于CPB组(P＜0.01)，另外SACP组动物脑组织HIF-1α的表达显著高于DHCA组(P＜ 0.01)，见图2。复灌3 h后DHCA组及SACP组NGB的表达均显著高于CPB组(P＜0.01)，此外SACP组动物脑组织NGB的表达显著高于DHCA组(P＜0.01)，见图3。

Figure 2.HIF-1αlevels in the frontal cortex at180min of reperfusion determined byWestern blotanalysis.Mean±SD.n=5.＊＊P＜0.01 vs DHCA group.图2　W estern blot检测脑皮质HIF-1α蛋白的水平

Figure 3.The neuroglobin(NGB)levels in the frontal cortex at180 min of reperfusion determined byWestern blot.Mean±SD.n= 5.＊＊P＜0.01 vs DHCA group.图3　W estern blot检测脑皮质神经珠蛋白的水平

3脑皮质HIF-1α及NGBm RNA的表达结果

在再灌注3 h后应用real-time PCR方法检测3组动物皮质HIF-1α及NGB的mRNA表达。复灌3 h后DHCA组及SACP组HIF-1α的mRNA水平均明显高于CPB组(P＜0.01);有脑灌注的SACP动物脑组织HIF-1α的mRNA水平显著高于DHCA组(P＜0.05)。另外再灌注3 h后DHCA组及SACP组NGB的mRNA水平均明显高于CPB组(P＜0.01);有脑灌注的SACP动物脑皮质组织中NGB的mRNA水平显著高于DHCA组(P＜0.05)，见图4。

Figure 4.ThemRNA expression of HIF-1αand neuroglobin(NGB)in the frontal cortex at180 min of reperfusion determined by realtime PCR.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs DHCA group.图4　Real-time PCR检测脑皮质HIF-1α及NGB的m RNA表达水平

讨论

目前对DHCA脑损伤的机制研究认为，脑组织在停循环期间及再灌注后经历一系列复杂的代谢环境变化过程，代谢环境的急剧变化及缺血缺氧刺激诱导脑神经细胞及胶质细胞产生应答机制，启动一系列相关蛋白因子的表达，这一过程被认为是脑组织应对DHCA脑损伤的修复机制的一部分。HIF-1是细胞在缺氧条件下产生的核蛋白，是由α亚基和β亚基组成的具有转录活性的异源二聚体，HIF-1α是其中的主要活性亚基，组织缺氧过程中与靶基因增强子或启动子上的缺氧反应元件(hypoxia response element，HRE)结合，启动目的基因的转录，发挥其对组织缺血缺氧的反应机制［4］。目前发现的HIF-1的靶基因包括促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)基因、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因及葡萄糖载体蛋白1的编码基因等，这些基因编码的蛋白因子对缺血缺氧后组织修复具有重要作用［5］。HIF-1是组织应对缺氧缺血的重要应答因子与启动环节，有研究显示慢性缺氧动物脑组织中检测到HIF-1蛋白表达的上调，亦有研究发现HIF-1高表达基因型大鼠脑组织对缺氧刺激的耐受能力显著高于野生型［2］，提示HIF-1表达上调对热缺血损伤脑组织具有保护作用。目前对于DHCA脑损伤过程中HIF-1的表达变化及其是否参与脑组织应对DHCA脑损伤的相关机制尚未有文献报道。

NGB是近年发现的存在于脊椎动物中枢神经系统的对氧有高亲和力的珠蛋白，在成年大鼠脑皮层、海马回、丘脑、下丘脑、嗅球和小脑等部位均检测到NGB的广泛表达，已被证实与脑局灶性缺氧缺血相关［6］。有研究证实NGB过表达基因型鼠较野生型对缺血缺氧有较强的抵御能力［7］。NGB对脑组织缺血缺氧损伤的保护作用可能与维持线粒体功能及清除氧自由基有关，NGB与氧分子有高亲和性，可以协助氧气通过血脑屏障，并且在神经组织代谢过程中增加氧的运输、储存和供应。另有研究发现NGB在大脑不同区域的表达与该区域对局部缺血的敏感性成反比，海马回等部位对缺血的高敏感性和易损性与此类区域的NGB表达偏低相关［8］。目前针对脑卒中过程中NGB所起作用已有诸多研究涉及，但对DHCA脑损伤过程中NGB蛋白的表达变化尚未得到充分研究。

本研究首次通过幼猪模型研究了DHCA过程中HIF-1与NGB的表达变化及其相互关系，证实DHCA可导致HIF-1与NGBmRNA与蛋白表达的上调，其变化可持续到再灌注后3 h。同时我们也观察到了存在脑灌注(SACP)条件下HIF-1与NGB mRNA与蛋白表达亦出现上调，且两者的表达水平显著高于无脑灌组。本研究结果证实了HIF-1参与了针对DHCA脑损伤的反应机制，鉴于先前研究已经证实HIF-1对热缺血损伤脑组织具有保护作用，我们推断HIF-1表达升高是脑组织应对DHCA脑损伤启动的自我保护机制，而且SACP组动物脑组织HIF-1表达的大幅提高提示其与SACP的脑保护作用有一定关联。另一方面，本研究在动物实验中证实NGB参与了脑组织对DHCA脑损伤的反应机制，目前对于低氧诱导NGB表达的具体机制尚不清楚，但本研究观察到NGB的表达在SACP组脑组织中要显著高于无脑灌组，提示NGB表达上调可能参与了SACP的脑保护机制。既往有研究发现HIF-1α特异性siRNA可以在小鼠体内抑制增强子诱导的NGB表达［9］。另外有文献报道HIF-1的诱导因子，如钴和去铁敏等，均能增强NGB的表达，提示在低氧条件下HIF-1可介导NGB的表达［10］。HIF-1作用靶基因的共同特点是在启动子或增强子中含有HIF-1结合位点缺氧反应原件，而在NGB基因5’端非编码区也发现了多条HIF-1结合位点相同序列，提示NGB可能为HIF-1的靶基因之一，在机体对脑缺血的应答过程中两者之间可能存在一定功能联系［11］。本研究结果证实在深低温停循环期间HIF-1与NGB存在共同的表达上调趋势，提示两者间可能存在功能联系，但HIF-1是通过何种途径介导NGB的表达上调尚需要进一步研究。

综上所述，本研究利用幼猪DHCA模型证实了HIF-1与NGB的表达上调参与了脑组织对DHCA脑损伤的反应机制，同时亦证实了两者的表达上调可能与SACP的脑保护机制相关。

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Expression of hypoxia-inducible factor 1 and neuroglobin in piglet cortex during deep hypotherm ic circulatory arrest

LIANG Meng-ya，TANG Zhi-xian，CHEN Guang-xian，RONG Jian，DAI Gang，WU Zhong-kai
(The Second Department of Cardiac Surgery，The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China.E-mail:wuzkdr@126.com)

R654.1;R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.010

1000-4718(2015)05-0823-05

2014-12-08［修回日期］2015-03-12

国家自然科学基金资助项目(No.81400307)

Tel:020-87332200;E-mail:wuzkdr@126.com