何铃，方梅霞，陈利国△，袁静，周建华，徐婧(暨南大学医学院中医系，实验动物管理中心，广东广州5063)

高血压病血瘀证相关miRNA的筛选*

何铃1，方梅霞2，陈利国1△，袁静1，周建华1，徐婧1
(暨南大学1医学院中医系，2实验动物管理中心，广东广州510632)

目的:筛选与高血压病血瘀证相关微小RNA(microRNA，miRNA)，从基因组学探索高血压病血瘀证的发病机制。方法:运用高血压病气虚血瘀证、气滞血瘀证、寒凝血瘀证、热结血瘀证、非血瘀证患者和健康人的血清干预人脐静脉血管内皮细胞CRL-1730，建立高血压病血瘀证血管内皮细胞损伤模型;提取各组总RNA，采用Solexa高通量测序法和数字基因表达谱测序原理对各组样本进行测序分析，筛选各组间的差异表达miRNA和mRNA，使用靶基因miRWalk预测软件对2者进行相关性的整合，筛选与血瘀证相关miRNA，qRT-PCR定量分析验证miRNA的表达。结果:整合气虚血瘀组与非血瘀组、气滞血瘀组与非血瘀组、寒凝血瘀组与非血瘀组、热结血瘀组与非血瘀组相关数据后，在高表达的基因群中发现SAT1-Hsa-miR-199a-5p和ATF4-Hsa-miR-1283;qRT-PCR定量检测Hsa-miR-199a-5p和Hsa-miR-1283在高血压病血瘀证组和非血瘀证组中的上调与下调趋势与基因测序结果一致。结论:Hsa-miR-199a-5p和Hsa-miR-1283可能是高血压病血瘀证形成的特异性相关miRNA。

高血压病;血瘀证;微小RNA

［ABSTRACT］AIM:To screen themiRNA related to blood stasis syndrome and to explore the geneticmechanism of blood stasis syndrome in hypertension.METHODS:Human umbilical vein endothelial cell line CRL-1730 was co-cultured with the human sera from healthy normal controls and hypertension patients to establish a blood stasis-hypertension cellmodela.The hypertension patients showed qideficiency and blood stasis，qistagnation and blood stasis，cold retaining and blood stasis，heat retaining and blood stasis and non-blood stasis syndromes.The endothelial cellmodels of blood stasis in hypertension were established.Target cells were collected for total RNA extraction.The techniques of Solexa(highthroughput sequencing method)and digital gene expression profiling were applied for screening the targetmiRNA，and miRWalk software was used for online prediction themRNA whichmight be the relevant target.qRT-PCR was conducted to confirm the prediction.RESULTS:SAT1-Hsa-miR-199a-5p and ATF4-Hsa-miR-1283 were found to be highly expressed in these cellmodels.The expression ofmiR-1283 and miR-199a-5p was confirmed by qRT-PCR.CONCLUSION:miR-199a-5p and miR-1283 may be the relevantmiRNA for the prediction of blood stasis syndrome in hypertension.

［KEY WORDS］Hypertension;Blood stasis syndrome;MicroRNA

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约为21～24 nt的小分子单链非编码RNA(non-conding RNA，ncRNA)，能够和互补或者部分互补的靶基因mRNA的3’UTR结合，引起mRNA降解或介导其翻译抑制［1］。这类小RNA在进化上具有高度的保守性，在表达上具有时间和组织特异性，是调节其它功能基因表达的重要调节分子，在生物体的各种生命过程中发挥着重要作用［2］。

根据血瘀证形成机理复杂、受多种因素影响的病因病机特点，以及血瘀证各型有其共同病理生理特点的研究结果，结合最近关于miRNA被发现在心血管系统疾病中具有重要作用［3］、某些特异性的miRNA能调节血管内皮细胞功能等研究成果，我们利用已建立的病证结合血瘀证血管内皮细胞损伤模型，采用Solexa和数字基因表达谱(digital gene expression profiling，DGE)测序原理对临床上的高血压病气虚血瘀证(qi deficiency and blood stasis，QDBS)、气滞血瘀证(qi stagnation and blood stasis，QSBS)、寒凝血瘀证(cold retaining and blood stasis，CBS)、热结血瘀证(heat retaining and blood stasis，HBS)、非血瘀证(non-blood stasis，NBS)患者及健康人对照(normal control，NC)血清干预人脐静脉血管内皮细胞进行miRNA测序分析，筛选与高血压病血瘀证相关的miRNA，从中挖掘出在高血压病血瘀证形成过程中起作用的miRNA，从miRNA方面来研究高血压病血瘀证的发病机制。

材料和方法

1细胞模型的建立

1.1收集血清2011年12月至2012年6月期间，在广州医科大学附属第二医院确诊者中收集到高血压病血瘀证和高血压病非血瘀证患者52例。以上患者均为原发性高血压病患者，诊断符合《1999年世界卫生组织/国际高血压联盟关于高血压治疗指南》中“高血压病”诊断标准;血瘀证患者诊断参照2011年修订的血瘀证诊断标准;排除有靶器官损害或糖尿病。2组患者的血压分级、性别分布、血压和年龄差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性(表1)。暨南大学医学院中医系一年级本科生健康志愿者30人作为正常对照组。患者组及对照组均空腹取血，采血前均未使用任何药物，无菌采集前臂静脉血入无菌带帽不抗凝干燥试管，自凝后4℃、2 000 r/min离心15 min，取上清液置无菌EP管，56℃灭活30 min，冻存于－20℃备用。

表1　52例高血压病患者基本情况Table 1.The basic situation of the 52 cases of patients with hypertension(Mean±SD)

1.2细胞培养将人脐静脉内皮细胞株CRL-1730，按1×108/L，接种于25 mL培养瓶，每瓶4 mL，用含10%胎牛血清的完全培养基培养24 h后，换无血清培养液再培养24 h后，分别以高血压病气虚血瘀组、气滞血瘀组、寒凝血瘀组、热结血瘀组、高血压病非血瘀组和正常组病人的血清进行继续培养24 h，建立高血压病气虚血瘀组、气滞血瘀组、寒凝血瘀组、热结血瘀组、高血压病非血瘀组和正常组6个分组的细胞模型。收集细胞，并用Trizol(Invitrogen)抽提总RNA。

2差异mRNA及m iRNA筛选

Illumina测序基于HiSeq 2000而属于配对末端测序，简化为PE测序，通过cDNA库产生的片段进行测序，分别从5’和3’造成的配对末端读取，定义为read 1和read 2。为方便测序数据的分析、发布和共享，Illumina HiSeq 2000测序得到的原始图像数据经过Base Calling转化为序列数据，即FASTQ格式，得到最原始的测序数据。DGE测序使用二代基因Illumina测序技术，由上海美吉生物科技有限公司完成。测序完成后则对原始统计数据进行质量评估，保留高质量的序列，并与人类基因组序列比较。根据比较结果，统计每个样本转录的FPKM值。最后对所有转录基因的表达量进行组间差异显著表达分析，按照差异基因的筛选条件，当P＜0.01、FDR＜0.001且|log2ratio|≥1即达到极显著差异的水平，可认为找到表达显著差异的相关筛选基因。

3整合分析差异表达的m iRNA和mRNA

利用靶基因在线预测软件miRWalk(http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/predictedmirnagene.html)预测各差异表达的mRNA可能结合的miRNA，同时考虑mRNA与miRNA表达量上的反比关系，将气虚血瘀组与非血瘀组、气滞血瘀组与非血瘀组、寒凝血瘀组与非血瘀组、热结血瘀组与非血瘀组4组中共有的差异表达mRNA和miRNA进行结合筛选。

4qRT-PCR验证

为了验证基因表达谱测序的可靠性，实验利用qRT-PCR技术，选择测序结果表达量较高，差异比较显著的2个miRNA，用qRT-PCR试剂盒检测其表达量，采用2－ΔΔCt法进行数据统计分析。最后将结果进行log2ratio计算。

5统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0统计软件进行分析，组间均数资料采用t检验，各组间均数资料采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1测序原始数据量统计及质量分析结果

测序得到的原始图像数据经过Base Calling转化为FASTQ文件，文件包含测序序列的序列信息以及reads的测序质量信息。对测序后得到的原始数据进行质控作图，原始数据碱基分布图见图1、2;为保证后续生物信息分析的质量，对原始序列进行一系列过滤以去除杂质数据，得到干净高质量的序列。本文在此基础上进行分析。

Figure 1.Base distribution map of the original data.图1　原始数据的碱基分布图

2血瘀证差异表达的m iRNA的筛选结果

利用Solexa测序原理对以上6组样本进行miRNA测序分析，分析样本中各miRNA的表达量，结果显示:(1)气虚血瘀组与正常组:共检测到miRNA976个，其中差异表达的miRNA有580个(P＜0.05)，表达下调的miRNA 227个，表达上调的miRNA 353个;(2)气滞血瘀组与正常组:共检测到miRNA 979个，其中差异表达的miRNA有576个，表达下调的miRNA 249个，表达上调的miRNA 327个; (3)寒凝血瘀组与正常组:共检测到miRNA 973个，其中差异表达的miRNA有620个，表达下调的miRNA 176个，表达上调的miRNA 444个;(4)热结血瘀组与正常组:共检测到miRNA 1 077个，其中差异表达的miRNA有535个，表达下调的miRNA 203个，表达上调的miRNA 332个;(5)气虚血瘀组与非血瘀组:共检测到miRNA974个，其中差异表达的miRNA有624个，表达下调的miRNA 271个，表达上调的miRNA 353个;(6)气滞血瘀组与非血瘀组:共检测到miRNA 978个，其中差异表达的miRNA有607个，表达下调的miRNA 268个，表达上调的miRNA339个;(7)寒凝血瘀组与非血瘀组:共检测到miRNA 972个，其中差异表达的miRNA有659个，表达个，其中差异表达的miRNA有585个，表达下调的miRNA 243个，表达上调的miRNA 342个;(9)非血瘀组与正常组:共检测到miRNA 890个，其中差异表达的miRNA 668个，表达下调的miRNA 324个，表达上调的miRNA 344个，见图3。

Figure 2.Mass distribution of the original data.图2　原始数据的碱基质量分布图

Figure 3.The number of differentially expressed miRNA.图3　差异表达的m iRNA数量

3各血瘀证组与正常对照组及非血瘀证组差异表达m iRNA的整合分析

整合分析各个血瘀证组与正常组及非血瘀证组的差异表达的miRNA，结果显示:(1)既在气虚血瘀组与正常组中差异表达又在气虚血瘀组与非血瘀组中差异表达的miRNA有383个，其中下调152个，上调231个;(2)既在气滞血瘀组与正常组中差异表达又在气滞血瘀组与非血瘀组中差异表达的miRNA有380个，其中下调154个，上调226个; (3)既在寒凝血瘀组与正常组中差异表达又在寒凝血瘀组与非血瘀组中差异表达的miRNA有455个，其中下调131个，上调324个;(4)既在热结血瘀组与正常组中差异表达又在热结血瘀组与非血瘀组中差异表达的miRNA有359个，其中下调134个，上调225个，见表2。

4血瘀证特有m RNA和m iRNA的整合筛选

整合气虚血瘀组与非血瘀组、气滞血瘀组与非血瘀组、寒凝血瘀组与非血瘀组、热结血瘀组与非血瘀组4组差异表达基因的结果发现:共同存在的差异表达基因301个，共同存在的差异表达的miRNA共300个。利用miRWalk软件在线预测各差异表达的mRNA可能结合的miRNA，同时考虑表达量上的反比关系，将4组中共有的差异表达mRNA和miRNA进行结合筛选，结果在高表达的基因群中发现SAT1-Hsa-miR-199a-5p和ATF4-Hsa-miR-1283。

5qRT-PCR验证m iR-1283和m iR-199a-5p在高血压病血瘀证的表达量

qRT-PCR结果显示，miR-1283和miR-199a-5p在各血瘀证组中显著低于非血瘀证组，且与测序结果趋势基本一致，说明测序结果是可信的，见图4。

表2　整合各血瘀证组与正常及非血瘀证组的差异表达m iRNA情况Table 2.The integration of the number of differentially expressed miRNA in blood stasis groups，NC group and NBS group

Figure 4.Gene expression ratio detected by DGE sequencing and qRT-PCR.图4　DGE测序与定量PCR检测基因表达量的比对

6高血压病血瘀证组与正常及非血瘀证组m iR-1283和m iR-199a-5p的qRT-PCR表达量

qRT-PCR实验结果显示，与高血压病非血瘀证组比较，各高血压病血瘀证组miR-1283的表达量明显降低(P＜0.05);与高血压病非血瘀证组比较，高血压病气虚血瘀证组、气滞血瘀证组和寒凝血瘀证组miR-199a-5p的表达量明显降低(P＜0.01或P＜0.05);而高血压病热结血瘀证组miR-199a-5p表达量下降不明显(P＞0.05);正常组与非血瘀证组比较miR-1283及miR-199a-5p的表达量均升高不显著(P＞0.05)，见表3。

表3　各高血压病血瘀证组与正常及非血瘀证组m iR-1283和m iR-199a-5p的表达量Table 3.The relative expression levels of miR-1283 and miR-199a-5p in blood stasis groups，NC group and NBS group(Mean±SD.n=3)

讨论

原发性高血压(essentialhypertension)又称高血压病，是临床最为常见的心血管疾病。中医认为血瘀是高血压病的重要病因之一，在高血压病的发生和发展过程中起重要作用。

近年来越来越多的研究发现，miRNA参与冠状动脉粥样硬化性心脏病、高血压、心肌肥厚、心律失常等心脏疾病的发生、发展机制［4］，在心血管系统疾病及微血管病变中具有重要作用［5］。miRNA作为细胞内的调节因子，参与生长发育、分化、细胞凋亡、代谢等过程，它可以在转录水平和转录后水平上影响功能基因的表达丰度，据推测人类基因组中有约1/3的基因受microRNA调控［6］，有研究发现，miR-1283靶基因与细胞浸润、增殖及凋亡有关［7-10］。郑丹凤等［11］的研究发现，miR-1283高表达可以抑制HTR-8/SVneo细胞的增殖及浸润，促进凋亡。张振辉等［12］研究发现miR-199a-5p在心肌肥大动物和细胞模型中表达量发生上调，miR-199a-5p过表达能促进体外培养的心肌细胞肥大，而阻遏miR-199a-5p的作用能抑制Ang II诱导的心肌细胞肥大。且有研究显示，miR-199a-5p与冠心病血瘀证有关，这与其可能会减轻炎症和凋亡有关［13］。ATF4(activating tran-scription factor 4)是一种激活转录因子。研究认为，ATF4表达的增加是内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)的重要标志，是ERS致凋亡的关键分子［14］，ERS是导致心脑组织缺血梗塞、神经退行性疾病等发生的重要环节［15］，广泛参与多种慢性疾病的发生与发展。内质网是细胞内蛋白质合成折叠、Ca2+储存和脂质合成的重要部位。内质网稳态的破坏导致大量错误或者未折叠蛋白质在内质网中的聚集，通过相应的信号通路，引起一系列的细胞反应，即ERS。ERS是心血管疾病(高血压心肌肥厚、动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤、糖尿病性心肌病等)发病的重要细胞分子机制、亦是心血管疾病治疗的新靶点，受到高度关注。SAT1基因编码的蛋白质属于乙酰转移酶家族，是一个速率限制的多胺代谢酶。催化亚精胺和精胺的乙酰化，并参与细胞内的多胺含量和运输的细胞的调节。目前有研究发现SAT1参与细胞的损伤与应激，当存在一些应激因素(如中毒、感染及缺氧)时，SAT1的活性会反射性的增高。根据血瘀证形成机理复杂、受多种因素影响的病因病机特点，以及血瘀证各型有其共同病理生理特点的研究结果，我们认为，使用Solexa等技术，获取并鉴定损伤后的血管内皮细胞中与血瘀证各型相关的miRNA，具有筛选和发现与血瘀证相关的生物标志物的可能性，能够显示出在血瘀证诊断和治疗中的独特价值。

本课题通过基因芯片技术筛选发现高血压病各型血瘀证、非血瘀证患者之间miRNA存在显著差异，提示高血压病血瘀证的发病与miRNA相关;且结果显示高表达的基因群中SAT1-Hsa-miR-199a-5p和ATF4-Hsa-miR-1283在血瘀证各组和非血瘀证组中表达量具有显著差异，提示miR-199a-5p和miR-1283可能为高血压病血瘀证相关的特异性miRNA。对于这2个miRNA的具体调控机制还有待我们进一步的细胞和动物实验进行研究验证。

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Screening of hypertension/blood stasis syndrome-related m iRNA in endothelial cellmodels

HE Ling1，FANGMei-xia2，CHEN Li-guo1，YUAN Jing1，ZHOU Jian-hua1，XU Jing1
(1Department of Traditional Chinese Medicine，School of Medicine，2Institute of Laboratory Animal Science，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail:tchenly@jnu.edu.cn)

R259.441

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.009

1000-4718(2015)05-0817-06

2014-10-22［修回日期］2015-01-21

国家自然科学基金资助项目(No.81173157);广东省自然科学基金资助项目(No.10151063201000045)

Tel:020-85226476;E-mail:tchenly@jnu.edu.cn