袁青,赵蓉,俞裕天,李星儿,陈飞,刘龙琳,曹勇,郎建英



靳三针对宫内窘迫HIBD大鼠大脑皮质Cyt-c和Caspase-3表达的影响

袁青1,赵蓉2,俞裕天3,4,李星儿5,陈飞6,刘龙琳3,曹勇3,郎建英7

(1.广州中医药大学针灸康复临床医学院,广州 510405;2.广州市医药技术学校,广州 510430;3.广州中医药大学,广州 510405;4.佛山市禅城区中心医院,佛山 528031;5.华南师范大学激光运动医学实验室,广州 510006;6.广州市十三行国医馆,广州 510415;7.广州中医药大学基础医学院,广州 510405)

目的 探讨靳三针对宫内窘迫HIBD大鼠大脑皮质Cyt-c和Caspase-3表达的影响,揭示靳三针对大脑的保护机制。方法 SD雌性大鼠妊娠21 d时剖腹,用止血钳夹闭双侧子宫角血管5 min,剖宫产取出幼鼠经行为学及脑组织切片确认缺氧缺血性脑损伤的为模型大鼠,随机分为模型组、针刺组。模型组不针刺;针刺1组、针刺2组、针刺3组、针刺4组分别于出生后第3、5、7、14天开始针刺,连续7 d;正常对照组自然分娩,不造模不针刺。所有组别大鼠均于出生后21 d断头取脑组织,检测大脑皮质中Cyt-c和Caspase-3的表达。结果 4个针刺组的Cyt-c光密度值都有所下降,其中针刺1组、针刺2组与模型组比较差异有统计学意义(＜0.05)。针刺1组Caspase-3的表达被明显下调,与模型组比较差异有统计学意义(＜0.05)。结论 出生后第3天开始针刺对宫内窘迫HIBD大鼠脑的保护作用与Cyt-c和Caspase-3表达的下调有关。

针刺;靳三针;HIBD;Cyt-c;Caspase-3;大鼠

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是指由围生期窒息引起的足月儿和近足月儿(胎龄≥34周)的缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD),特点是在出生第1天出现,可伴惊厥样动作、通气不足或呼吸暂停,原始反射和脑干反射表现受抑制等表现,其显著病理变化是脑血流异常。HIE是导致新生儿死亡和不可逆性脑损伤的主要原因[1],重者可遗留脑性瘫痪、癫痫等难治性儿童脑病[2],轻者也可能是导致患者今后学习障碍、轻瘫、细微运动问题、注意力缺陷及高反应性的危险性升高的原因。因此,如何有效改善HIE所致的病理状况一直是医学界研究的重要内容之一。在既往研究中,我们用5 min延迟剖宫产模拟胎儿宫内窒息的病理进程,成功建立了HIBD新生大鼠模型[3],本研究采用免疫组化染色法观察不同针刺介入时间对大脑皮质Cyt-c和Caspase-3表达情况,以探讨针刺治疗HIBD的最佳介入时机。

1 材料与方法

1.1 实验动物

已明确预产期的妊娠SD雌性大鼠21只,体重210～290 g,来源于南方医科大学实验动物科技发展有限公司[SCXK(粤)2006-0015]。造模手术及针刺在广州中医药大学实验中心屏障动物实验室[SYXK(粤) 2008-0001]进行。

1.2 主要试剂及仪器

Cyt-c试剂盒,Caspase-3试剂盒(SIGMA公司),二抗、SABC(北京中杉金桥生物技术有限公司),显微镜(奥林巴斯,BX50),穗片牌美容针灸针(0.28 mm× 13 mm,100支/盒)、大龙移液器[10mL、200mL、1000mL,大龙兴创实验仪器(北京)有限公司]等。

1.3 造模方法

造模孕鼠接受经Bjelke法改良的延迟剖宫产术[4]和巨容等用自制血管带阻断雌鼠子宫角血管造模法[5]改良而成,孕鼠妊娠21 d上午,不麻醉颈错位法处死,仰卧位置于手术板上,沿腹中线剪开皮肤、肌肉,打开腹腔,暴露双侧子宫,用4个血管钳分别夹闭双侧上下子宫角血管,立即计时开始,将事先浸泡于37℃生理盐水中的无菌纱布覆盖在子宫上,不断更换纱布,保持局部温度。到达5 min立即撕破子宫,挤出新生大鼠,撕掉胎盘,保留脐带,用干棉球擦去口、鼻部羊水,置于37℃恒温水浴箱中垫有干毛巾的搪瓷托盘上保暖。取出全部新生大鼠的时间不超过2 min。

通过对新生大鼠进行翻正、斜坡及悬吊等行为学测试及HE染色的脑组织切片中的神经细胞死亡程度进行定位和定性分析,比较各组行为差异及同一时段的正常组、模型组新生大鼠脑组织HE染色中死亡的神经细胞数量、范围和出现部位,确认出现全脑皮层广泛、典型的神经细胞死亡为造模成功[3,6]。

1.4 针刺方法

实验新生大鼠分正常组、模型组、针刺1组、针刺2组、针刺3组、针刺4组。代乳鼠自然分娩的幼鼠为正常组,不针刺;行延迟剖宫产后不针刺的幼鼠为模型组;延迟剖宫产后第3天开始行针刺操作的幼鼠为针刺1组;延迟剖宫产后第5天开始行针刺操作的幼鼠为针刺2组;延迟剖宫产后第7天开始行针刺操作的幼鼠为针刺3组;延迟剖宫产后第14天开始行针刺操作的幼鼠为针刺4组,4组针刺组均连续针刺7 d,针刺选取“靳三针疗法”中的“脑三针”、“颞三针”、“智三针”[7],参照《实验针灸学》[8],结合人与动物骨度类比,每个穴位模拟得气后(大鼠有叫唤、挣扎等反应)行捻转手法,持续、均匀捻转20 s,捻转幅度±180°,频率120次/min,不留针。所有组别的SD大鼠均于出生后21 d处死。

1.5 标本采集

对到达预定观察点的大鼠经行为学评估后,将大鼠处死,断头取脑,冰盘操作,快速剥离颅骨后取出脑组织,生理盐水冲洗后即可置入4%中性甲醛溶液固定,之后用全自动生物组织脱水机进行脱水、浸蜡、包埋、切片,待测。

1.6 指标检测

采用免疫组织化学染色法,操作简要如下。TO型生物制片透明剂充分脱蜡,梯度乙醇水化,3%H2O2避光孵育10 min;流水冲洗2 min,浸泡于柠檬酸盐缓冲液中,高压锅加压后1300 W(180℃)煮3 min;冷却至室温,PBS浸洗3 min×4次,山羊血清封闭20 min;不洗,分别滴加稀释浓度为1:75的兔抗大鼠Cyt-c和Caspase-3抗体,4℃孵育过夜;PBS浸洗3 min×4次,滴加生物素化山羊抗兔IgG,37℃孵育20 min;PBS浸洗3 min×4次,滴加SABC复合物,37℃孵育20 min; PBS浸洗3 min×4次,滴加DAB显色液,镜下控制显色约3～5 min,观察颜色显现淡橘色时,流水冲洗终止显色;滴加苏木素染液3 min,流水冲洗2 min,1%氨水浸洗数秒,流水中再冲洗2 min;脱水,中性树胶封片,镜检。细胞核蓝染,细胞浆或细胞膜出现棕黄色颗粒沉着的细胞即是阳性细胞。阴性对照以0.01 mmol/L PBS代替一抗,其余免疫组化步骤同上。

1.7 图像处理

每个脑组织在显微镜40倍物镜下,定位于顶叶外侧大脑皮质椎体细胞层,左右对称,各取3个连续视野,用广州明美图像处理软件进行拍照,所得照片的统计场总面积均为1768185.44mm,用北京航空航天图像处理软件对照片自动进行阳性细胞光密度值计算,6张图片所得数据求平均值,作为该脑组织大脑皮层观察区的Cyt-c和Caspase-3阳性细胞光密度值。

1.8 统计学方法

所有实验数据用均数±标准差表示,采用SPSS18.0软件进行统计学处理,多组计量资料的均数比较用单因素方差分析(-),多组间两两比较用法。所有统计结果均以＜0.05作为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠脑组织缺血灶中Cyt-c的表达

模型组Cyt-c光密度值明显高于正常组,差异有统计学意义(＜0.05),说明宫内窘迫所造的HIBD大鼠Cyt-c的表达被明显提高。4个针刺组的Cyt-c光密度值都有所下降,其中针刺1组、针刺2组与模型组比较差异有统计学意义(＜0.05),提示3 d开始针刺和5 d开始针刺能更好地降低Cyt-c表达。详见表1、图1。

表1 各组大鼠脑组织Cyt-c光密度值比较 (±s)

表1 各组大鼠脑组织Cyt-c光密度值比较 (±s)

组别nCyt-c光密度值 正常组80.328±0.125 模型组80.619±0.4201) 针刺1组80.431±0.4552) 针刺2组80.455±0.2042) 针刺3组80.592±0.202 针刺4组80.555±0.196

注:与正常组比较1)＜0.05;与模型组比较2)＜0.05

正常组模型组针刺1组 针刺2组针刺3组针刺4组

2.2 大鼠脑组织缺血灶中Caspase-3的表达

表2 各组大鼠脑组织Caspase-3光密度值比较 (±s)

表2 各组大鼠脑组织Caspase-3光密度值比较 (±s)

组别nCaspase-3光密度值 正常组80.290±0.182 模型组80.602±0.1481) 针刺1组80.312±0.1122) 针刺2组80.688±0.249 针刺3组80.534±0.294 针刺4组80.681±0.112

注:与正常组比较1)＜0.05;与模型组比较2)＜0.05

模型组Caspase-3光密度值明显高于正常组,差异有统计学意义(＜0.05),说明宫内窘迫所造的HIBD大鼠脑组织Caspase-3的表达被明显提高。仅有针刺1组Caspase-3的表达被明显下调,与模型组比较差异有统计学意义(＜0.05),提示3 d开始针刺能明显下调Caspase-3的表达。详见表2、图2。

正常组模型组针刺1组 针刺2组针刺3组针刺4组

3 讨论

大鼠大脑皮质经过HIBD后神经细胞的死亡有两种形式,即坏死和凋亡。Caspase家族在HIBD中发挥着重要作用,其中Caspase-3是Caspase级联“瀑布”下游最关键的凋亡蛋白酶,在各种因素启动的凋亡程序中起最后的枢纽作用[9]。

Cyt-c的释放是细胞凋亡的重要环节之一。在HIBD的条件下,线粒体处于能量缺乏状态,使其通透性转运孔开放,释放出Cyt-c等与凋亡相关的活性物质,直接启动凋亡途径。Cyt-c定位于线粒体内膜上,是在呼吸链中电子传递必需的一类色素蛋白,其色素辅基是含铁的卟啉衍生物。Cyt-c在激活Caspases,诱导细胞凋亡方面具有重要意义。一旦Cyt-c释放,就将激活细胞凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)介导的DEVD (ASP-Glu-Val-ASP序列)特异的Caspase蛋白水解酶(DEVD-Specific protease),引起快速凋亡一种源于电子传递被阻断的缓慢坏死过程而使细胞死亡[10]。在此过程中,Cyt-c与Apaf-1及dATP结合,继之激活Caspase-9,然后这作为依赖Cyt-c的Caspases级联反应的始动因子,再先后激活Caspase-3以及Caspase- 2、6、8、10等效应Caspase, 最终导致细胞凋亡。

Marsden等人[11]的研究显示线粒体不是凋亡引发器,而具有某种扩大Caspase级联的作用。

本研究首次应用宫内窘迫HIBD大鼠进行试验,宫内窘迫HIBD大鼠较以往的HIBD大鼠模型更好地模拟了新生儿缺血缺氧(HIE)的整个生理病理状况[3],本次实验显示,该模型脑组织神经元中Cyt-c、Caspase-3的表达都明显增加。

我们应用靳三针疗法对该模型进行干预,实验结果提示,各组Cyt-c的表达均有所下降,而Caspase-3的表达并无发现明显规律;出生后第3天就开始针刺的HIBD大鼠(针刺1组),Cyt-c、Caspase-3的表达都得到明显的下调。我们的同期研究也提示,各针刺组凋亡细胞均有所减少,而针刺1组与模型组比较差异有统计学意义。因此,针刺1组的结果提示,在宫内窘迫引起的HIBD发生后第3天起连续行靳三针疗法,可以明显抑制神经细胞的凋亡[12],而针刺对神经细胞凋亡的抑制作用很可能是通过下调Cyt-c、Caspase-3水平来实现的,该结果与以往的研究结论[13]相近。其余针刺组均无出现Cyt-c、Caspase-3水平的同时下调,提示及早对HIBD进行针刺干预能明显改善病情。

靳三针疗法为主治疗小儿脑病已有20余年,疗效肯定,国家中医药管理局已将“靳三针治疗儿童精神发育迟滞和儿童自闭症临床规范化研究”两项成果作为临床适宜疗法向全国推广[14-15]。目前对靳三针治疗小儿脑病的临床研究很多,对其作用机理的基础研究较少。本实验结果表明,出生后3 d即进行靳三针疗法可以下调HIBD大鼠脑组织Cyt-c、Caspase-3的表达水平,并且初步提示,及早行靳三针疗法可能通过抑制线粒体Cyt-c途径的细胞凋亡而起到脑保护的作用。

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Effect of Jin’s Three-needle Scalp Electroacupuncture on Cyt-c and Caspase-3 Expressions in the Cerebral Cortex in Intrauterine Distress-induced HIBD Rats

1,2,-3,4,-5,6,-3,3,-7.

1.,510405,; 2.,510430,; 3.,510405,4.,528031,; 5.,510006,; 6.,510415,; 7.,510405,

Objective To investigate the effect of jin’s three-needle scalp electroacupuncture on Cyt-c and Caspase-3 expressions in the cerebral cortex in Intrauterine distress-induced HIBD rats and reveal the mechanism of its protective action on the brain. Method The abdomen was incised in a female SD rat at 21 days of pregnancy. Bilateral uterine horn blood vessels were tightly clamped with a hemostat for five minutes. An infant rat was then taken out by a cesarean section. A rat model of hypoxic-ischemic brain damage was confirmed by the use of a behavior test and brain tissue sections. The rats were randomized into model and acupuncture groups. The model group was not needled. Acupuncture groups 1, 2, 3 and 4 began to be needled at 3, 5, 7 and 14 days after birth, respectively. Acupuncture treatment was given for seven consecutive days. The normal control group was naturally delivered, not used to make a model and not needled. All groups of rats were decapitated to take the brain tissue at 21 days after birth. Cyt-c and Caspase-3 expressions in the cerebral cortex were detected. Result Cyt-c optical density value decreased somewhat in the four acupuncture groups; there was a statistically significant difference between acupuncture group 1 or 2 and the model group (＜0.05). Caspase-3 expression was significantly down-regulated in acupuncture group 1; there was a statistically significant difference compared with the model group (＜0.05). Conclusion The protective effect of acupuncture beginning at 3 days after birth on the brain is related to the down-regulation of Cyt-c and Caspase-3 expressions in intrauterine distress-induced HIBD rats.

Acupuncture; Jin’s three needles; HIBD; Cyt-c; Caspase-3; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.08.0794

2015-01-10

国家自然科学基金项目(81072878,81373713)

袁青(1961 - ),男,教授,硕士生导师

俞裕天(1987 - ),男,在站博士后,Email:195824064@qq.com