腾佳丽，刘彦君

IGF1对高糖下内皮细胞增殖及移行的影响

腾佳丽，刘彦君

摘要目的观察高糖下胰岛素样生长因子1（IGF1）对高糖下人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖和移行的影响，并探讨其可能影响机制。方法体外培养HUVEC，分为对照组、高糖组、高渗组、高糖＋IGF1组和高糖＋IGF1＋AZD5363组，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测内皮细胞增殖，Transwell小室观察细胞移行。实时荧光定量PCR测定丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶（Akt）及叉头转录因子1（FoxO1）的mRNA水平。免疫组化法测定内皮细胞Akt、p-Akt、FoxO1和p-FoxO1的蛋白表达，并行半定量分析。结果与对照组比较，高糖组细胞存活率、移行率明显降低，FoxO1 mRNA表达明显升高，FoxO1／p-FoxO1蛋白表达增加，Akt／p-Akt比值增加，差异均有统计学意义（P＜0．05）。与高糖组比较，高糖＋IGF1组细胞存活率、移行率明显增加，FoxO1 mRNA的表达明显降低，FoxO1／p-FoxO1蛋白表达降低，Akt／p-Akt蛋白表达降低，差异均有统计学意义（P＜0．05）；高糖＋IGF1＋AZD5363组细胞存活率未见明显差异，移行未增加，FoxO1 mRNA的表达明显降低（P＜0．05），FoxO1／p-FoxO1未见明显差异。5组AktmRNA的表达差异无统计学意义。结论IGF1能改善高糖对内皮细胞增殖移行的抑制作用，其机制可能是IGF1激活Akt进一步调节FoxO1的表达。

关键词IGF1；FoxO1；高糖；内皮细胞；细胞增殖；移行

研究［1］显示糖尿病患者心脑血管病变及周围血管闭塞的风险远高于非糖尿病患者。研究［2］显示高血糖与糖尿病血管病变有关，内皮细胞功能失调可能继发于高血糖。胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）是细胞生长、分化和凋亡的重要调节因子。研究［3］证明IGF1具有多种代谢和血管保护作用，从很多方面直接对抗内皮功能失调，目前关于IGF1的报道［4］多关注其在神经损伤方面的研究，在血管保护方面的报道较少，且机制不清。IGF1可激活磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）／丝氨酸－苏氨酸蛋白激酶（serine／threonine kinase，Akt）通路，调控叉头转录因子-1（forkhead transcription factor 1，FoxO1）表达［3］。高糖可能通过PI3K／Akt的解偶联参与糖尿病血管并发症的发展［5］。该研究拟探讨IGF1对高糖下内皮细胞增殖及移行的保护作用及其可能机制。

1　材料与方法

1．1主要材料与仪器

人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）获赠于中科院生物物理研究所（购自ATCC细胞库），由解放军306医院实验室保存，第2～5代的细胞用于本研究。内皮细胞培养液（endothelial cell growth medium，EGM）（瑞士lonza公司）；含有EDTA的胰酶（美国Gibco公司）；D-葡萄糖粉、缺乏生长因子的IV型胶原纤维（美国Sigma公司）；RNAiso及Q-PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；抗-Akt单克隆抗体、抗磷酸化特异性Thr308Akt单克隆抗体、抗-FoxO1单克隆抗体、抗磷酸化特异性Ser256 FoxO1单克隆抗体（美国Cell Signaling公司）；抗β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的抗鼠抗体、免疫组化DAB发光试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；Akt抑制剂（AZD5363，美国Selleck公司）；6、24、96孔板、24孔板Transwell小室（美国Corning公司）；PCR引物由上海生物工程技术有限公司合成；AIRTECH超净工作台（天津钧星瑞科技有限公司）；7500 Real Time PCR System（美国Applied biosystems公司）；一体式微型化学发光成像仪（SmartChemi，北京赛智创业科技有限公司）；电子显微镜（ICC50 HD，德国LEICA公司）。

1．2方法

1．2．1HUVEC的培养

用EGM培养基（含2%进口胎牛血清），在37℃、5%CO2条件下进行培养，瓶底被细胞铺满80%时，用0．25%胰酶消化、传代，取2～5代增殖旺盛的细胞用于实验。随机分为5组进行干预：对照组（5 mmol／L葡萄糖）；高糖组（25 mmol／L葡萄糖）；高糖＋IGF1组（25 mmol／L葡萄糖＋80 ng／m l IGF1）；高糖＋IGF1＋AZD5363组（25

2015－04－29接收

1．2．2HUVEC增殖实验

将1×105个细胞／孔接种于0．1%IV型胶原纤维处理后的96孔板。无血清培养24 h后更换EGM培养液，按照不同方式分5组进行干预，终体积为200μl／孔。培养48 h后，弃上清液，每孔依次加入EGM培养液和四甲基偶氮唑蓝（MTT）溶液20μl（5 mg／ml），继续培养4 h后弃上清液，每孔加入DMSO 150μl，置摇床室温均匀震荡10 min，使结晶物充分溶解。酶标仪检测波长490 nm处吸光度（absorbance，A）值。按照下列公式计算细胞存活率：细胞存活率（%）＝实验组A值／对照组A值×100%。

1．2．3Transwell小室检测HUVEC迁移

将细胞按照5×105个细胞／孔接种于0．1%IV型胶原纤维处理后的24孔板，上室EGM培养液每孔500μl，下室为对照组、高糖组、高糖＋IGF1组、高糖＋IGF1＋AZD5363组和高渗组培养液各1．5 ml，培养12 h后取出上室，刮除膜上层内皮细胞，10%甲醛溶液固定后结晶紫染色，于光学显微镜下随机6个视野计数，取均值。计算迁移抑制率，迁移抑制率（%）＝（对照组迁移细胞数－实验组迁移细胞数）／对照组迁移细胞数×100%。

1．2．4采用SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量PCR检测Akt、FoxO1 mRNA表达

将5×105个细胞／m l接种于6孔培养板，按照对照组、高糖组、高糖＋IGF1组、高糖＋IGF1＋AZD5363组和高渗组培养48 h后，Trizol法提取5组细胞总RNA，RT-PCR扩增目的基因。PCR引物序列为FoxO1上游引物：5′-GGCTGAGGGTTAGTGAGCAG-3′；FoxO1下游引物：5′-AAGGGAGTTGGTGAAAGACATC-3′；Akt上游引物：5′-CTCATTCCAGACCCACGAC-3′；Akt下游引物：5′-ACAGCCCGAAGTCCGTTA-3′；β-actin上游引物：5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′；β-actin下游引物：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。反应参数：95℃预热变性30 s；两步法PCR：95℃变性15 s；60℃退火34 s；扩增40个循环；60℃延伸1 min。应用7500 System Software分析软件，检测目的基因与内参扩增的Ct值，根据ΔΔCt＝ΔCt实验组－ΔCt对照组，计算ΔΔCt值，得到实验组目的基因相对于对照组目的基因的表达量（relative quantity，RQ），RQ＝2－ΔΔCt，然后进行统计分析。

1．2．5免疫组化法检测细胞Akt／p-Akt、FoxO1／p-FoxO1蛋白表达

制备细胞爬片，培养细胞48 h后，进行免疫组化检测。在高倍镜下随机观察3个视野，计数细胞并对每个细胞进行评分。细胞不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，深棕黄色为3分。将评分之和除以细胞数作为FoxO1蛋白表达强度，表达率（%）＝（实验组表达强度／对照组表达强度）×100%。计算Akt／p-Akt、FoxO1／p-FoxO1蛋白的值。

1．3统计学处理

2　结果

2.1IGF1对高糖下HUVEC生存率的影响

MTT结果显示，设对照组培养48 h时的HUVEC细胞存活率为100%，则高渗组HUVEC的细胞存活率为93．71%，与对照组比较差异无统计学意义（P＞0．05）；高糖组细胞存活率为69．10%，明显低于对照组（P＜0．05）。对照组细胞存活率与高渗组存活率差异无统计学意义（P＞0．05）；与对照组比较，高糖组细胞存活率明显降低（t＝6．48，P＜0．05）。与高糖组比较，高糖＋IGF1组细胞存活率明显增加（t ＝2．90，P＜0．05）；高糖＋IGF1＋AZD5363组细胞存活率未见明显改变（t＝0．28，P＞0．05）。见表1。

表1　5组细胞生长比较（n＝4¯±s）

表1　5组细胞生长比较（n＝4¯±s）

与对照组比较：*P＜0．05；与高糖组比较：＃P＜0．05

组别A值　细胞存活率（%）0．86±0．07 100高糖0．59±0．04*69．10±4．65高糖＋IGF1 0．71±0．07＃83．30±8．14高糖＋IGF1＋AZD5363 0．60±0．01*69．77±1．16高渗对照0．80±0．04 93．71±4．65

2.2IGF1对高糖下HUVEC迁移的影响与对照组比较，高糖组细胞迁移抑制率显著增高（t＝5．27，P＜0．05）。与高糖组比较，高糖＋IGF1组的细胞迁移抑制率显著降低（t＝7．21，P＜0．05）；高糖＋IGF1＋AZD5363组的细胞迁移抑制率未见明显改变（t＝0．31，P＞0．05）。高渗组中HUVEC迁移数与对照组比较差异无统计学意义（t＝0．12，P＞0．05）。见表2。

2.3IGF1对高糖下Ak t、FoxO1 m RNA表达的影响高糖组FoxO1 mRNA的表达量与对照组比较明显降低（6．00±0．65 vs1．14±0．15，t＝12．62，P＜0．05）。与高糖组比较，高糖＋IGF1组FoxO1 mRNA的表达量明显增加（2．73±1．52 vs6．00±0．65，t＝3．42，P＜0．05），高糖＋IGF1＋AZD5363组FoxO1 mRNA的表达量明显降低（2．97±1．04 vs 6．00±0．65，t＝4．27，P＜0．05）。5组AktmRNA的表达差异无统计学意义（F＝0．39，P＞0．05）。见图1。

表2　5组HUVEC细胞迁移的比较（n＝5±s）

表2　5组HUVEC细胞迁移的比较（n＝5±s）

与对照组比较：*P＜0．05；与高糖组比较：＃P＜0．05

组别　迁移数　迁移抑制率（%）45．8±12．4 0高糖16．0±2．3*65．1±5．02高糖＋IGF1 26．6±2．3＃41．9±5．02高糖＋IGF1＋AZD5363 16．6±3．6*63．8±7．86高渗对照45．0±8．9 1．7±1．94

2.4IGF1对高糖下Akt、p-Akt、FoxO1和p-FoxO1蛋白表达的影响

与对照组比较，高糖组的FoxO1／p-FoxO1比值升高（4．50±1．15 vs 1．08± 0．14，t＝5．10，P＜0．05）；与高糖组比较，高糖＋IGF1组FoxO1／p-FoxO1比值降低（2．15±0．29 vs 4．50±1．15，t＝3．41，P＜0．05），高糖＋IGF1＋AZD5363组的FoxO1／p-FoxO1比值与高糖组差异无统计学意义（6．22±1．19 vs4．50±1．15，t＝1．81，P＞0．05），高渗组FoxO1／p-FoxO1比值与对照组差异无统计学意义（1．10±0．08 vs 1．08±0．14，t＝0．25，P＞0．05）。与对照组比较，高糖组的Akt／p-Akt比值升高（3．95±1．12 vs1．03±0．07，t＝4．50，P＜0．05）；与高糖组比较，高糖＋IGF1组Akt／p-Akt比值降低（1．92±0．35 vs3．95±1．12，t＝2．99，P＜0．05），高糖＋IGF1＋AZD5363组的p-Akt未见表达，Akt／p-Akt比值接近正无穷，高渗组Akt／p-Akt比值与对照组差异无统计学意义（1．12±0．06 vs 1．03±0．07，t＝1．71，P＞0．05）。见图2。

3　讨论

研究［6］表明，高糖可抑制细胞增殖，干扰细胞周期，诱发DNA损伤并可轻度加速细胞死亡，最终导致糖尿病血管病变的发生［7］。内皮细胞稳态失调被认为是糖尿病血管并发症发生发展过程中的重要始动因素［8］。糖尿病因血管并发症导致的致残致死率逐年升高，可能与糖尿病患者血管形成侧支循环的能力下降有关［9］。研究［10］表明，IGF1对内皮细胞有明确保护作用。本研究中结果显示高糖对HUVEC增殖及移行有明显的抑制作用，表明高糖具有细胞毒性作用；加入IGF1可明显改善高糖的抑制作用。

内皮细胞表达的FoxO1蛋白可激活其下游的多种因子，加速细胞凋亡［10］。为探究IGF1是否通过影响Akt-FoxO1通路的Akt活性进而调控FoxO1的表达，本研究在高糖＋IGF1基础上进一步加入Akt阻滞剂AZD5363后显示FoxO1／p-FoxO1未降低反而增高，Akt活化受抑制，p-Akt未发现表达，此时Akt／p-Akt无意义。其原因可能是在加入Akt阻滞剂后PI3K／Akt活化减弱，FoxO1去磷酸化，重新转位于细胞核内，去磷酸化的FoxO1在核内发挥转录活性，抑制内皮细胞的增殖移行功能。研究［11］表明PI3K-Akt-FoxO1信号通路在血管生成及内皮细胞生长与存活中发挥重要作用。IGF1可激活PI3K／Akt，活化的Akt可使FoxO1发生磷酸化而发生核输出，由核内转至细胞质中，失去转录活性，从而抑制细胞的凋亡［12］。本研究的结果与报道［12－13］一致，说明IGF1是通过Akt-FoxO1通路保护内皮细胞增殖及移行的功能。为高糖下因FoxO1高表达所导致的内皮细胞功能受损提供了直接依据。提示IGF1保护血管内皮细胞的作用是通过调控FoxO1表达实现的。

本研究结果显示，高糖抑制FoxO1 mRNA水平的表达，但在蛋白表达水平上FoxO1／p-FoxO1比值增高，说明高糖抑制了FoxO1的磷酸化。IGF1使高糖下FoxO1 mRNA的表达量明显增加，高糖＋IGF1 ＋AZD5363后FoxO1 mRNA的表达量明显降低，但FoxO1／p-FxoO1比值显著升高，可能是其他信号通路对FoxO1蛋白表达的影响，具体信号通路机制有待进一步研究。5组中AktmRNA的表达未发现明显变化，可能是IGF1对Akt的调节作用主要体现在蛋白表达水平。

本研究显示高渗组对实验结果未产生影响，排除高糖处理下的高渗状态对内皮细胞实验结果的影响。本研究推测IGF1是通过激活Akt影响下游FoxO1／p-FoxO1水平进而调节内皮细胞的增殖及移行达到保护血管内皮的作用，IGF1对减缓糖尿病血管并发症的发生和发展具有重要意义。FoxO蛋白在血管病变发生发展中的作用和机制目前尚不清楚，进一步研究需通过核实动物模型来探索FoxO在体内变化的病理生理学意义，加强对糖尿病血管病变发病机制的探讨，为糖尿病血管病变的防治做出更大贡献。

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中图分类号R 587．1；R 587．2

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）10－1373－05

基金项目：国家自然科学基金重点项目（编号：21331001）

作者单位：安徽医科大学解放军第306临床学院内分泌科，北京100101

作者简介：腾佳丽，女，硕士研究生；刘彦君，女，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：liuyanj＠yeah．netmmol／L葡萄糖＋80 ng／ml IGF1＋5μmol／L AZD5363）；高渗组（20 mmol／L甘露醇＋5 mmol／L葡萄糖）。

Effects of IGF1 on proliferation and m igration of endothelial cells on high glucose

Teng Jiali，Liu Yanjun
（Dept of Endocrinology，306 Teaching Hospital of Anhui Medical University，Beijing100101）

AbstractObjectiveTo investigate the effects and the possiblemechanism of insulin like growth factor-1（IGF1）on proliferation and migration of human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）in high glucose．Methods Cultured HUVEC were divided into 5 groups（control group，high glucose group，hypertonic group，high glucose＋IGF 1 group，high glucose＋IGF1＋AZD5363 group）．The proliferation was detected bymethyl thiazolyl tetrazolium（MTT），themigration was detected by transwellchamber．ThemRNA expressions of serine／threonine kinase（Akt）and FoxO1 were detected by real-time PCR．The protein expressions of FoxO1／p-FoxO1 and Akt／p-Aktwere detected by immunohistochemisty．Resu ltsCompared with the control group，the rate of cell survival in high glucose group decreased significantly（P＜0．05），the transitional was decreased significantly（P＜0．05），the mRNA expression of FoxO1 was increased significantly（P＜0．05），the protein expressions of FoxO1／p-FoxO1 and Akt／p-Aktwere increased．Compared with high glucose group，the cell survival rate and migration rate in high glucose＋IGF1 group were increased significantly，the mRNA expression of FoxO1 was decreased significantly（P＜0．05），the protein expressions of FoxO1／p-FoxO1 and Akt／p-Aktwere decreased．Compared with high glucose group，the cell survival rate andmigration rate in high glucose＋IGF1＋AZD5363 group had no significant difference，themRNA expression of FoxO1 was decreased significantly（P＜0．05），the protein expressionsof FoxO1／p-FoxO1 had no significant difference．ThemRNA expression of Akt in five groups had no significant difference．ConclusionIGF1 can improve the proliferation andmigration of endothelial cell in high glucose．It shows that IGF1 acts through Akt to promote FoxO1 phosphorylation．

Key wordsinsulin-like growth factor 1；forkhead transcription factors；high glucose；endothelia cells；proliferation；migration