李保山，查小雪，朱德发，康冬梅

甲状腺素联合多奈哌齐对成年期甲状腺功能减退症大鼠海马syntaxin-1的影响

李保山1，查小雪2，朱德发2，康冬梅1

摘要目的观察甲状腺素（T4）联合多奈哌齐对成年期甲状腺功能减退症（甲减）大鼠的海马内突触前膜相关蛋白1 （syntaxin-1）表达的影响，探讨甲减脑损伤及可能的恢复机制。方法44只SD大鼠随机分为4组：对照组、甲减组、T4替代治疗组及T4和多奈哌齐联合治疗组。通过饮水给予丙基硫氧嘧啶0．05%建立成年期大鼠甲减模型共6周。第5周开始，对照组腹腔注射等量生理盐水，T4替代治疗组每日给予左旋甲状腺素（L-T4）6μg／100 g体重（BW）腹腔注射，联合治疗组每日给予6μg／100g BW L-T4腹腔注射及饮用水中加入0．005%多奈哌齐。采用免疫组织化学法和Western blot法分析4组大鼠海马syntaxin-1的表达情况。结果与对照组比较，甲减组大鼠血清三碘甲状腺原氨酸（T3）、T4水平减低，促甲状腺激素（TSH）水平升高（P＜0．01），海马内syntaxin-1在CA1、CA3各层及齿状区多形层（DG-PL）表达显著增加（P＜0．01）；T4替代治疗后，血清T3、T4和TSH水平恢复至正常水平，syntaxin-1蛋白的表达未完全恢复到对照组水平（P＜0．05）；T4联合多奈哌齐治疗后syntaxin-1蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义。结论T4联合多奈哌齐治疗可以修复成年期甲减导致的脑损伤。

关键词甲状腺功能减退症；甲状腺素；多奈哌齐；syntaxin-1；海马

成年期甲状腺功能减退症（甲减）可引起广泛的中枢神经系统损伤和功能障碍，其机制可能与甲状腺素（thyroxine，T4）的缺乏引起突触可塑性改变有关［1］。突触融合蛋白1（syntaxin-1）是特异性分布在神经细胞突触前膜上的蛋白，通过与SNAP-25和synaptobrevin／VAMP蛋白聚合，进而形成被认为是神经突触囊泡融合必要因子的SNARE核心复合体，与突触可塑性有关［2］。海马是负责认知和学习的神经结构基础，主管空间记忆和事件记忆的形成。研究［3］显示T4缺乏引起的认知功能障碍可能与海马内的syntaxin-1水平升高有关，常规剂量的T4替代治疗并不能使syntaxin-1水平完全恢复。该研究用丙硫氧嘧啶（propylthiouracil，PTU）建立成年期大鼠甲减模型，旨在探讨T4联合多奈哌齐对成年期甲减大鼠海马syntaxin-1表达水平的影响。

1　材料与方法

1．1实验动物

成年雄性SD大鼠44只，12周龄，普通级，体重260～300 g，南京实验动物中心提供。

1．2主要仪器及试剂

三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、T4放射免疫试剂盒购自北方生物技术研究所；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的兔抗山羊IgG购自美国Santa Cruz公司；HRP标记的GAPDH单抗购自上海康成生物工程有限公司；山羊抗大鼠抗syntaxin-1蛋白多克隆抗体、DAB试剂盒、SP-022生物素标记羊抗兔IgG超敏试剂盒均购自北京博奥森公司；DFM 296型16管放射免疫γ计数器购自合肥众成机电技术开发有限公司；DXM 1200F光学显微镜购自日本尼康公司；JEDR801D形态学图像分析系统购自江苏捷达科技发展有限公司；PTU、左旋甲状腺素（L-T4）及多奈哌齐购自美国Sigma公司；VE-180垂直电泳槽、EPS-300电泳仪、VE-186转膜电槽购自上海天能科技有限公司。

1．3模型制备

大鼠适应性喂养1周，随机分为4组，每组11只：对照组、甲减组、T4替代治疗组（T4组）、联合治疗组（T4＋多奈哌齐组），用 0．05% PTU饮水6周建立成年期大鼠甲减模型。第5周起，对照组予以等量生理盐水腹腔注射；T4组每日腹腔注射6μg／100 g体重（body weight，BW）L-T4；T4＋多奈哌齐组每日腹腔注射6μg／100 g BW T4并在饮用水中加入0．005%多奈哌齐。治疗时间为2周。

1．4标本制备

血清制备：造模结束，称重，水合氯

2015－05－07接收

230001

2安徽医科大学第一附属医院老年内分泌科，合肥230022

脑标本制备：取血结束将大鼠断头处死，冰上取脑组织，右脑置于4%多聚甲醛溶液中固定待做免疫组化染色，左脑分离出海马组织后于－80℃冰箱保存待做Western blot检测。

1．5甲状腺激素水平测定

采用放射免疫法检测血清T3、T4、TSH水平，检测过程严格按照试剂盒说明书。

1．6免疫组化染色

采用超敏SP法行免疫组化检测。通过光学显微镜拍摄海马CA1、CA3和齿状回（dentate gyrus，DG）区，采用生物图像分析系统对DG区的分子层（ML）和多形层（PL），CA1区的起始层（SO）、放射层（SR）和腔隙分子层（SLM），CA3区的SO层、透明细胞层（SL）和SR层的syntaxin-1免疫反应产物进行光密度（optical density，OD）值分析，取其平均OD值。

1.7突触小体提取及W estern blot法检测

4℃

生理盐水冲洗海马组织，去除血液，滤纸拭干，玻璃匀浆器中匀浆，提取突触小体后通过Western blot法检测syntaxin-1蛋白，具体操作参照文献［3］进行。分析条带相对OD值，通过syntaxin-1与内参GAPDH的条带OD值的比值来间接反映syntaxin-1的表达量。

1．8统计学处理

2　结果

2.1大鼠血清T3、T4及TSH水平

与对照组比较，甲减组大鼠血清T3、T4水平显著降低，而TSH水平则显著升高（F＝8．765、33．264、26．809，P＜0．01）；T4组大鼠血清T3、T4及TSH水平恢复至正常水平（P＞0．05）；联合治疗组大鼠血清T3、T4及TSH水平与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。见表1。

表1　各组大鼠血清甲状腺激素水平比较（n＝11，±s）

表1　各组大鼠血清甲状腺激素水平比较（n＝11，±s）

与对照组比较：**P＜0．01；与甲减组比较：＃P＜0．05，＃＃P＜0．01

组别　T3（nmol／L）　T4（nmol／L）　TSH（μIU／m l）0．81±0．02　48．88±1．12　1．05±0．12甲减　0．59±0．03**　19．08±1．67**19．68±3．03**T4　0．81±0．06＃＃　51．74±1．93＃＃　1．19±0．33＃＃T4＋多奈哌齐　0．75±0．07＃　52．81±1．94＃＃　1．04±0．13对照＃＃

2.2免疫组化法检测大鼠海马各区syntaxin-1表达

右脑组织切片，可见海马结构清晰，染色较强（阳性着色呈棕黄色）。光镜下观察，syntaxin-1免疫反应产物分布在CA1、CA3和DG区各层，呈棕黄色颗粒，在甲减组中CA1、CA3所有层区和DG-ML层棕黄色颗粒更为密集，T4组的DG-ML层和DGPL层的syntaxin-1表达较对照组较高，而syntaxin-1表达水平在T4＋多奈哌齐联合治疗组与对照组基本相似。见图1。

量化分析4组大鼠海马内CA1、CA3及DG区各层syntaxin-1免疫反应产物的OD值，与对照组比较，甲减组海马内CA1、CA3各层及DG-PL层表达显著增加（F＝9．279、7．182、7．423、5．202、5．060、4．014、2．250、3．139，P＜0．05）。T4组DG-ML和DG-PL层syntaxin-1的OD值仍大于对照组（F＝1．524、1．848，P＜0．05）。T4＋多奈哌齐联合治疗组各层syntaxin-1的OD值更接近于对照组（P＞0．05）。见表2。

与对照组比较：*P＜0．05，**P＜0．01

2.3W estern b lot法检测大鼠海马syntaxin-1表达变化

甲减组大鼠海马内syntaxin-1表达水平明显高于对照组，为对照组的1．38倍，差异有统计学意义（P＜0．05）；T4组和联合治疗组大鼠海马内syntaxin-1表达水平分别为对照组的1．29倍和1．17倍，与对照组比较差异无统计学意义（P＞0．05）。见图2。

3　讨论

本研究中，甲减组大鼠海马突触小体内syntaxin-1表达与对照组比较明显增加，与研究［3］结论基本一致。syntaxin-1蛋白是参与中枢神经系统神经递质释放的重要调节蛋白之一，研究［4－6］显示甲减大鼠模型中不同的组织syntaxin-1表达水平不一致。PTU诱导的甲减大鼠的脑前额叶中内syntaxin-1减少［4］，甲状腺切除的甲减模型的腺垂体内syntaxin-1表达也下调［5］，而垂体切除的甲减模型肾上腺内syntaxin-1表达升高［6］。研究［7］表明甲减可以导致T4或甲状腺激素受体（thyroid hormone receptor，TR）在不同的组织分布不同。提示syntaxin-1表达不一致可能与不同组织对甲状腺激素缺乏的反应性不同有关。

T4替代治疗是临床治疗甲减的经典方法，其标准是血清甲状腺激素恢复至正常水平，对甲减脑损伤修复程度的研究［6，8］结论并不一致。研究［6］显示常规T4替代治疗后甲减导致的突触相关蛋白未完全恢复至对照组水平，文献［8］显示常规T4替代治疗后突触相关蛋白表达水平完全恢复。本研究中T4组大鼠血清T3、T4及TSH水平恢复至正常水平，但是该T4水平下syntaxin-1表达未完全恢复至对照组水平。其原因可能是T4主要通过结合TRs发挥作用，与受体结合不够有关。研究［9］显示，在分别多次注射低剂量T3和单次注射大剂量T3后，TRs结合率分别是49%和86%。研究［10］显示，与低剂量T4比较，大剂量T4能够更有效的恢复树突棘数量。因此，大剂量的T4替代治疗可以增加TRs的结合率，从而发挥更大的生理效应。

T4替代治疗的同时加用多奈哌齐后，研究显示syntaxin-1的表达恢复至对照组水平。本研究首次显示这一现象，目前多奈哌齐作用机制尚不明确，研究［11］证明多奈哌齐对神经退行性病变具有独立的保护作用，能够保护大脑皮层神经元，增加神经元树突的长度和数量，避免海马线粒体损伤和延缓阿尔兹海默病海马萎缩。另外，多奈哌齐也被证明可以有效保护Tau蛋白病模型大鼠海马内突触相关蛋白和脊髓［12］。

综上所述，成年期甲减导致海马内syntaxin-1表达水平明显增加，T4替代治疗可以改善syntaxin-1表达水平，T4＋多奈哌齐联合治疗能够完全恢复。提示T4联合多奈哌齐对甲减导致的脑损伤的治疗更有价值。

参考文献

［1］时美琴，杨昊，朱德发．原发性甲状腺功能减退症对记忆功能的影响［J］．中国临床保健杂志，2008，11（5）：449-50．

［2］孙坚原，Thomas C Südhof．Syntaxin-1蛋白的多重功能［J］．生物物理学报，2011，27（10）：821－7．

［3］宁丹，朱杨波，沈玉先，等．成年期甲减大鼠海马syntaxin-1表达及甲状腺素干预效应［J］．安徽医科大学学报，2011，46 （11）：1138－41．

［4］Yang H Y，Sun C P，Jia X M，et al．Effect of thyroxine on SNARE complex and synaptotagmin-1 expression in the prefrontal cortex of ratswith adult-onset hypothyroidism［J］．JEndocrinol Invest，2012，35（3）：312－6．

［5］Quintanar JL，Salinas E．Effectof hypothyroidism on synaptosomal-associated protein of25 kDa and syntaxin-1 expression in adenohypophyses of rat［J］．JEndocrinol Invest，2002，25（9）：754－8．

［6］Hepp R，Grant N J，Chasserot-Golaz S，et al．The hypophysis controls expression of SNAP-25 and other SNAREs in the adrenal gland［J］．JNeurocytol，2001，30（9－10）：789－800．

［7］Broedel O，EravciM，Fuxius S，etal．Effects ofhyper-and hypothyroidism on thyroid hormone concentrations in regions of the rat brain［J］．Am JPhysiol Endocrinol Metab，2003，285（3）：E470 －80．

［8］Ambrogini P，Cuppini R，Ferri P，et al．Thyroid hormones affect neurogenesis in the dentate gyrus of adult rat［J］．Neuroendocrinology，2005，81（4）：244－53．

［9］Diez D，Grijota-Martinez C，AgrettiP，etal．Thyroid hormone action in the adult brain：gene expression profiling of the effects of single and multiple doses of triiodo-l-thyronine in the rat striatum ［J］．Endocrinology，2008，149（8）：3989－4000．

［10］Gloud E，Allan M D，McEwen B S．Dendritic spine density of adult hippocampal pyramidal cells is sensitive to thyroid hormone ［J］．Brain Res，1990，525（2）：327－9．

［11］Dong H，Yuede C M，Coughlan C A，et al．Effects of donepezil on amyloid-betaand synapse density in the Tg2576mousemodelof Alzheimer′s disease［J］．Brain Res，2009，1303：169－78．

［12］Shen H，Kihara T，Hongo H，etal．Neuroprotection by donepezil against glutamate excitotoxicity involves stimulation of alpha7 nicotinic receptors and internalization of NMDA receptors［J］．Br J Pharmacol，2010，161（1）：127－39．

中图分类号R 581．2；R 322．81；R 446．6-3；R 977．14

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）10－1390－04

基金项目：国家自然科学基金（编号：81272152）；安徽省科技计划项目（编号：12010402134）

作者单位：1安徽医科大学附属省立医院老年内分泌科，合肥

作者简介：李保山，男，硕士研究生；康冬梅，女，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：kangdongmei2006＠sina．com醛0．3 m l／100 g麻醉后打开腹腔，采取腹主动脉血，3 000 r／min离心10 min，取血清置于4℃冰箱保存待测T3、T4和促甲状腺激素（thyroid stim ulating hormone，TSH）。

Effects of thyroxin and donepezil on hippocampal syntaxin-1 expression in adult ratswith hypothyroidism

Li Baoshan1，Zha Xiaoxue2，Zhu Defa2，et al
（Dept of Geriatrics Endocrinology，1The Affiliated Provincial Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230001；2The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022）

AbstractObjectiveTo observe the effects of thyroxine（T4）and donepezil on hippocampal syntaxin-1 expression in adulthypothyroidism rats，and clarify the possiblemechanism under the hypothyroidism-induced cognitive dysfunction．MethodsThe Sprague-Dawley rats were randomly classified into four groups：normal control，hypothyroid（PTU：0．05%，add to the dringking water），hypothyroid receiving levothyroxine replacement therapy（6μg／100 g body weight once daily，ip injection），and a combination of both drugs（levothyroxine：6μg／100 g；donepezil 0．005%）．Serum T3，T4 and TSH concentrationswere obtained using a radioimmunoassay kit．Protein levels of syntaxin-1 were determined by immunohistochemistry and Western blot．ResultsCompared to the control，the serum T3 and T4 levels of the hypothyroid group rats were significantly decreased，serum TSH elevated，syntaxin-1 in the hippocampus was significantly increased in CA1，CA3 and DG-PL regions．After levothyroxine or combined with donepezil treatment，serum T3，T4 and TSH were returned to the normal．But treatmentwith levothyroxine alone failed to normalize the expression of syntaxin-1．The level of syntaxin-1 was restored completely to the control group．ConclusionOur findings suggest that adult-onset hypothyroidism may induce increment of syntaxin-1 in the hippocampus，which could be restored preferably by T4 combined with donepezil treatment．

Key wordshypothyroidism；thyroine；dozepezil；syntaxin-1；hippocampus