王君明，代永霞，陈玉龙，苗明三，张月月，李晓冰，崔瑛，屈凌波

·中医·中西医结合研究·

雷公藤与金钱草配伍抗食管癌作用的组成配比及其剂量效应关系研究

王君明，代永霞，陈玉龙，苗明三，张月月，李晓冰，崔瑛，屈凌波

背景中药雷公藤与金钱草配伍具有中医药理论依据、应用及现代研究基础，但迄今为止二者配伍在抗食管癌作用方面的研究鲜有报道。目的考察雷公藤与金钱草配伍抗食管癌增效作用的最佳质量配比及其剂量效应关系。方法2013年12月选取人食管癌Eca9706细胞，分为对照组、雷公藤组、金钱草组、1∶4组、1∶2组、1∶1组、2∶1组、4∶1组，分别提取水提取物和醇提取物，采用MTT法测量各组人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率，选取雷公藤与金钱草配伍抗食管癌增效作用的最佳质量配比，进一步分为对照组、5氟尿嘧啶(5－Fu)组、不同浓度醇提取物组(50、100、200、300、400μg/ml组)，测量人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率。结果与对照组比较，雷公藤组、金钱草组、1∶4组、1∶2组、1∶1组、2∶1组、4∶1组水提取物人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率升高(P＜0．05);与雷公藤组比较，金钱草组、1∶4组、1∶2组、1∶1组、2∶1组、4∶1组水提取物人Eca9706细胞增殖抑制率升高(P＜0．05);金钱草组、1∶4组、1∶2组、1∶1组、2∶1组、4∶1组水提取物人Eca9706细胞增殖抑制率比较，差异无统计学意义(P＞0．05)。与对照组比较，雷公藤组、金钱草组、1∶4组、1∶2组、1∶1组、2∶1组、4∶1组醇提取物人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率升高(P＜0．05);与雷公藤组比较，金钱草组、1∶4组、1∶2组醇提取物人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率降低，2∶1组、4∶1组醇提取物人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率升高(P＜0．05);与金钱草组比较，1∶1组、2∶1组、4∶1组醇提物人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率升高(P＜0．05);与2∶1组比较，4∶1组醇提取物人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率降低(P＜0．05)。雷公藤与金钱草配伍抗食管癌增效作用的最佳质量配比为2∶1。与对照组比较，5－Fu组、50μg/m l组、100μg/ml组、200μg/ml组、300μg/ml组、400μg/ml组人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率升高(P＜0．05);与5－Fu组比较，50μg/ml组、100μg/ml组、200μg/ml组人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率降低，300 μg/ml组、400μg/ml组人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率升高(P＜0．05);50μg/ml组、100μg/ml组、200μg/ml组、300μg/m l组、400μg/ml组人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率两两比较，差异均有统计学意义(P＜0．05)。半数抑制浓度(IC50值)为316μg/ml。结论雷公藤与金钱草配伍的醇提取物对人食管癌Eca9706细胞具有抗癌增效作用，二者最佳质量配比2∶1，浓度为50～400μg/ml时对人食管癌Eca9706细胞的抗癌增效作用呈现出明显的剂量效应关系。

食管肿瘤;雷公藤;金钱草;中药配伍;剂量效应关系;药物

王君明，代永霞，陈玉龙，等．雷公藤与金钱草配伍抗食管癌作用的组成配比及其剂量效应关系研究［J］．中国全科医学，2015，18(36):4496－4500．［www．chinagp．net］

Wang JM，Dai YX，Chen YL，et al．Component ratio and dose－response relationship of tripterygium wilfordii combined with lysimachia christinae in inhibiting esophageal cells［J］．Chinese General Practice，2015，18(36):4496－4500．

雷公藤为卫矛科植物雷公藤(Tripterygium Wilfordii Hook．f．)的干燥根，性寒，味苦、辛，归肝、肾经，功效祛风除湿、活血通络、消肿止痛和杀虫解毒，具有广谱抗癌活性，却毒性较大［1－4］，限制了其疗效发挥及应用。雷公藤与金钱草配伍具有减毒增效作用，然而其减毒增效的科学内涵依然未知。本研究旨在探讨雷公藤与金钱草配伍对人食管癌Eca9706细胞抗癌增效作用的最佳质量配比及其剂量效应关系，为雷公藤与金钱草配伍在抗癌尤其是防治食管癌的联合应用提供临床前初步实验依据。

1材料与方法

1．1细胞株2013年12月选取人食管癌Eca9706细胞，由河南中医学院分子生物学实验中心提供。

1．2试剂5氟尿嘧啶(5－Fu)购于上海伊卡生物技术有限公司，纯度≥99%〔高效液相色谱法(HPLC)〕，批号: EK140319。雷公藤:产地广西，批号:121101，经河南中医学院药学院生药学科陈随清教授鉴定为卫矛科植物雷公藤的干燥根。金钱草:产地广东，批号:130912，经河南中医学院药学院生药学科陈随清教授鉴定为报春花科植物过路黄(Lysimachia Christinae Hance)的干燥全草。RPMI1640培养基(Gibco公司)、胎牛血清(HyClone公司)、MTT(Amresco公司)、二甲基亚砜(DMSO)(Amresco公司)、胰蛋白酶－乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(0．25%)含酚红(Solarbio公司)。

1．3主要仪器酶标仪(BioTek ELx800uv)，Heraeus细胞培养箱(德国Kendro)，倒置显微镜(ZESS)，SG－603生物安全柜(Bake)，Milli－Q Advantage A10型超纯水机(Millipore)，3－18K高速冷冻离心机(Sigma)，DL5B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，XK96－B涡流混合器(姜堰市新康医疗器械有限公司)，BS210S型电子天平(北京塞多利斯天平有限公司)，DZF－6020真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，RE－52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，HH6数显恒温水浴锅(上海比朗仪器有限公司)。

1．4提取物的制备

1．4．1水提取物分别取雷公藤、金钱草、雷公藤与金钱草不同质量配比(1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1)的饮片，加10倍量水(W/V=1∶10)，浸泡1 h后，回流提取3次，2 h/次，以4 000 r/min离心10 min(离心半径9 cm)，合并离心上清液，回收水，减压干燥得干浸膏，称重。其中，雷公藤、金钱草、雷公藤与金钱草不同质量配比(1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1)的水提取物得率依次为9．9%、27．7%、36．5%、23．0%、29．3%、16．6%、12．5%。

1．4．2醇提取物分别取雷公藤、金钱草、雷公藤与金钱草不同质量配比(1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1)的饮片，加10倍量75%乙醇(W/V=1∶10)，浸泡1 h后，回流提取3次，2 h/次，以4 000 r/min离心10min(离心半径9 cm)，合并离心上清液，回收乙醇，减压干燥得干浸膏，称重。其中，雷公藤、金钱草、雷公藤与金钱草不同质量配比(1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1)的醇提取物得率依次为9．8%、23．8%、16．0%、15．3%、14．6%、14．1%、13．8%。

1．5分组人食管癌Eca9706细胞，配比筛选试验的水提取物和醇提取物各分8组，即对照组、雷公藤组、金钱草组、雷公藤与金钱草各配伍组(1∶4组、1∶2组、1∶1组、2∶1组、4∶1组)，各给药组剂量均为200μg/ml;选取雷公藤与金钱草配伍抗食管癌增效作用的最佳质量配比，固定质量配比剂量效应关系实验分7组，即对照组、5－Fu组、不同浓度醇提取物组(50μg/ml组、100μg/ml组、200μg/ml组、300μg/ml组、400μg/m l组)。水提取物配比筛选试验以双蒸水作为对照组，醇提取物配比筛选试验和固定质量配比剂量效应关系试验均以0．4%DMSO作为对照组，水提取物各药物组均用双蒸水溶解，5－Fu组和不同浓度醇提取物组均用DMSO溶解并使作用于细胞的DMSO终浓度不高于0．4%。

1．6 MTT法测定细胞增殖抑制率细胞培养:细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，每间隔48 h更换1次培养基，实验时细胞用消化液(0．02%EDTA和0．25%胰蛋白酶以1∶1比例配制)进行消化，并以1×104/孔接种于96孔培养板，于37℃、5%CO2培养箱培养24 h。每组设3个复孔，继续培养48 h，去除培养基上清液，每孔加入0．5mg/ml的MTT 100μl，继续培养4 h，小心吸去上清液，并加入150μl DMSO溶解紫色沉淀，用酶标仪在波长为570 nm/630 nm处测定吸光度〔D(λ)值〕。实验重复3次。按以下公式计算细胞增殖抑制率:细胞增殖抑制率采用SPSS 11．5统计学软件计算半数抑制浓度(IC50值)。

1．7统计学方法采用SPSS 11．5统计学软件进行数据分析，计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析(One－Way ANOVA)，组间两两比较采用最小显著差法(LSD－t)检验。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1水提取物人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率比较对照组、雷公藤组、金钱草组、1∶4组、1∶2组、1∶1组、2∶1组、4∶1组水提取物人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率比较，差异有统计学意义(P＜0．05);与对照组比较，雷公藤组、金钱草组、1∶4组、1∶2组、1∶1组、2∶1组、4∶1组水提取物人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率升高，差异有统计学意义(P＜0．05);与雷公藤组比较，金钱草组、1∶4组、1∶2组、1∶1组、2∶1组、4∶1组水提取物人Eca9706细胞增殖抑制率升高，差异有统计学意义(P＜0．05);金钱草组、1∶4组、1∶2组、1∶1组、2∶1组、4∶1组水提取物人Eca9706细胞增殖抑制率比较，差异无统计学意义(P＞0．05，见表1)。

表1对照组、雷公藤组、金钱草组及不同浓度水提取物组人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率比较(x±s，%)Table 1 Comparison of Eca9706 cell inhibition rate of water extract among the eight groups

2．2醇提取物人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率比较对照组、雷公藤组、金钱草组、1∶4组、1∶2组、1∶1组、2∶1组、4∶1组醇提取物人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率比较，差异有统计学意义(P＜0．05);与对照组比较，雷公藤组、金钱草组、1∶4组、1∶2组、1∶1组、2∶1组、4∶1组醇提取物人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率升高，差异有统计学意义(P＜0．05);与雷公藤组比较，金钱草组、1∶4组、1∶2组醇提取物人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率降低，2∶1组、4∶1组醇提取物人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率升高，差异有统计学意义(P＜0．05);与金钱草组比较，1∶1组、2∶1组、4∶1组醇提

本研究创新点:

食管癌是我国及世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一，由于早期诊断率低，即使手术切除，预后仍较差，全世界每年约有30万人死于此类疾病。随着新化疗药物的不断出现，以氟尿嘧啶和顺铂为基础的联合化疗使约50%的食管癌患者得以缓解，然而80%的患者就诊时已发生了广泛的转移，因此目前5年生存率仍低于30%。西医治疗在缩小瘤体方面有一定的优势，而中医治疗除具有直接抗肿瘤作用外，还可以配合放疗和化疗，起到减毒增效的作用，增强患者对放疗和化疗的耐受性，提高生存质量，延长生存期，因此，从中医药中寻找新的肿瘤防治药物及方式(如联合用药)是近年来研究的热点。雷公藤与金钱草联合用药具有中医药理论及临床应用依据，但二者配伍是否有抗癌增效作用及其剂量效应关系如何，迄今为止依然未知。本研究考察雷公藤与金钱草配伍的抗癌增效作用，明确其最佳质量配比及其剂量效应关系，为二者配伍在抗癌尤其是防治食管癌方面的应用提供了临床前实验基础。物人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率升高，差异有统计学意义(P＜0．05);与2∶1组比较，4∶1组醇提取物人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率降低，差异有统计学意义(P＜0．05，见表2)。雷公藤与金钱草配伍抗食管癌增效作用的最佳质量配比为2∶1。

2．3雷公藤与金钱草最佳质量配比的醇提取物对人食管癌Eca9706细胞抗癌增效作用的剂量效应关系对照组、5－Fu组、50μg/ml组、100μg/ml组、200μg/ml组、300μg/ml组、400μg/m l组人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率比较，差异有统计学意义(P＜0．05);与对照组比较，5－Fu组、50 μg/m l组、100μg/ml组、200μg/ml组、300μg/ml组、400 μg/ml组人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率升高，差异有统计学意义(P＜0．05);与5－Fu组比较，50μg/ml组、100 μg/m l组、200μg/ml组人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率降低，300μg/m l组、400μg/ml组人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率升高，差异有统计学意义(P＜0．05);50μg/ml组、100μg/m l组、200μg/ml组、300μg/ml组、400μg/ml组人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率两两比较，差异均有统计学意义(P＜0．05，见表3)。IC50值为316μg/ml。

3讨论

雷公藤与金钱草联合用药属于中药相杀配伍的范畴［5］，其中来自雷公藤的二萜、三萜类成分和金钱草所含的黄酮类成分均具有抗肿瘤作用［6－8］。然而，迄今为止，有关雷公藤与金钱草配伍在抗肿瘤活性上增效作用的研究鲜有报道，限制了雷公藤与金钱草配伍的科学合理应用。为了探索雷公藤与金钱草配伍的抗癌增效作用，本研究制备不同质量配比雷公藤与金钱草，选取人食管癌Eca9706细胞，通过体外MTT法观测雷公藤与金钱草配伍对人食管癌Eca9706细胞抗癌增效作用的质量配比，结果显示，雷公藤与金钱草配伍的醇提取物对体外人食管癌Eca9706细胞具有抗癌增效作用，二者质量配比应在2∶1～4∶1，且尤以在2∶1作用为佳，提示通过联合金钱草用药一方面可以对雷公藤起到抗癌增效作用，另一方面还可起到降低雷公藤用量从而以降低其中毒风险。此外，本研究通过体外MTT法观测了雷公藤与金钱草配伍抗癌增效作用的剂量效应关系，结果显示，雷公藤与金钱草质量配比为2∶1的醇提取物，在浓度为50～400μg/ml对人食管癌Eca9706细胞的抗癌增效作用具有良好的剂量效应关系，其IC50值为316μg/ml;进一步分析显示，雷公藤与金钱草配伍醇提取物浓度为300～400 μg/m l比5－Fu对人食管癌Eca9706细胞的抗癌增效作用强。本研究将为雷公藤与金钱草配伍抗癌尤其在防治食管癌的应用提供临床前初步实验依据。

本研究采用MTT法从体外细胞实验角度观察了雷公藤与金钱草配伍抗癌增效作用的最佳质量配比及其剂量效应关系，证实了雷公藤与金钱草配伍的抗癌增效作用，方法正确，结果可靠。众所周知，药物经体外实验取得的结果并不能完全反映其体内过程，而本文尚未考察雷公藤与金钱草配伍体内抗癌增效作用，是本研究的不足之一;进一步探讨二者配伍的体内抗癌增效作用及其机制，将是下阶段重要的研究方向之一。此外，下阶段深入研究不同质量配比的化学基础变化与抗癌增效作用的相关性及差异，从化学角度揭示雷公藤与金钱草配伍抗癌增效作用的科学内涵，将会推动雷公藤与金钱草配伍的应用进程。

利益冲突声明:本课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。无利益冲突。

表2对照组、雷公藤组、金钱草组及不同浓度醇提取物组人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率比较(x±s，%)Table 2 Comparison of Eca9706 cell inhibition rate of ethanol extract among the eight groups

表3对照组、5－Fu组、不同浓度醇提取物组人食管癌Eca9706细胞增殖抑制率比较(x±s，%)Table 3 Comparison of Eca9706 cell inhibition rate among control group，5－Fu group and groups of different concentrations of ethanol extract

［1］Wang JM，Jia YM，Cui Y．Research progress and strategy in toxicity of Tripterygium wilfordii Hook．f．with triptolide as the main anticancer bioactive component［J］．Lishizhen Medicine and Materia Medica Research，2012，23(2):1324－1326．(in Chinese)王君明，贾玉梅，崔瑛．基于以雷公藤甲素为主要抗癌活性成分的雷公藤毒性研究进展及对策［J］．时珍国医国药，2012，23 (2):1324－1326．

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Com ponent Ratio and Dose－response Relationship of Tripterygium W ilfordii Combined W ith Lysimachia Christinae in Inhibiting Esophageal Cells

WANG Jun－ming，DAIYong－xia，CHEN Yu－long，et al．Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment＆Chinese Medicine Development of Henan Province，Henan University of TCM，Zhengzhou 450046，China

【Abstract】BackgroundTripterygium wilfordii(LGT)/Lysimachia Christina(JQC)compatibility has bases in the theory of traditional Chinesemedicine(TCM)，clinical application and modern research．However，until now，research on their anti－esophageal cancer efficiency has been rarely reported．Objective To investigate the of optimal component ratio and doseresponse relationship of LGT combined with JQC in inhibiting esophageal cells．M ethods In December 2013，human Eca9706 esophageal cancer cells were selected and were divided into eight groups including control，LGT，JQC，1∶4，1∶2，1∶1，2∶1 and 4∶1 groups，and thewater extracts and ethanol extractswere prepared．MTT assay was used to determine the inhibition rate of cell proliferation，and thus the optimal component ratio of LGT combined with JQC in inhibiting Eca9706 cells was determined．The group with the optimal ratio was further divided into control group，5－Fu group and groups with different concentrations of ethanol extracts(50，100，200，300 and 400μg/ml group)．Results Compared with control group，LGT group，JQC group，1∶4 group，1∶2 group，1∶1 group，2∶1 group and 4∶1 group were higher in the Eca9706 cell inhibition rate ofwater extract(P＜0．05);compared with LGT group，JQC group，1∶4 group，1∶2 group，1∶1 group，2∶1 group and 4∶1 group were higher in the Eca9706 cell inhibition rate of water extract(P＜0．05);JQC group，1∶4 group，1∶2 group，1∶1 group，2∶1 group and 4∶1 group were not significantly different in Eca9706 cell inhibition rate of water extract(P＞0．05)．Compared with control group，LGT group，JQC group，1∶4 group，1∶2 group，1∶1 group，2∶1 group and 4∶1 group were higher in the Eca9706 cell inhibition rate of ethanol extract(P＜0．05);compared with LGT group，JQC group，1∶4 group and 1∶2 group were lower in Eca9706 cell inhibition rate of ethanol extract(P＜0．05)，and 2∶1 group and 4∶1 group were higher in the Eca9706 cell inhibition rate of ethanol extract(P＜0．05);compared with JQC group，1∶1 group，2∶1group and 4∶1 group were higher in the Eca9706 cell in hibition rate of ethanol extract(P＞0．05);compared with 2∶1 group，4∶1 group was lower in the Eca9706 cell inhibition rate of ethanol extract(P＜0．05)．The optimal component ratio of of LGT combined with JQC in inhibiting Eca9706 cellswas2∶1．Compared with control group，5－Fu group，50μg/ml group，100μg/ml group，200μg/m l group，300μg/m l group and 400μg/ml group were higher in Eca9706 cell inhibition rate(P＜0．05);compared with 5－Fu group，50μg/m l group，100μg/ml group and 200μg/ml group were lower in Eca9706 cell inhibition rate(P＜0．05)，and 300μg/ml group and 400μg/ml group were higher in Eca9706 cell inhibition rate(P＜0．05);50μg/ml group，100μg/ml group，200μg/ml group，300μg/ml group and 400μg/ml group were significantly different in Eca9706 cell inhibition rate(P＜0．05)．IC50value was 316μg/ml．Conclusion The ethanol extract of LGT－JQC compatibility has synergistic effect on Eca9706 cell proliferation，The ethanol extract of LGT－JQC with the optimal component ratio of 2∶1 and a concentration of 50－400μg/ml shows obvious dose－response relationship in inhibiting the proliferation of Eca9706 cells．

Esophageal neoplasms;Tripterygium wilfordii;Lysimachia christinae;Compatibility(TCD);Doseresponse relationship;Drug

R 735．1

A

10．3969/j．issn．1007－9572．2015．36．020

2015－04－15;

2015－08－27)

(本文编辑:陈素芳)

国家自然科学基金青年科学基金项目(81503269);中国博士后科学基金(2012M521412);河南中医学院省属高校基本科研业务专项人才培养项目(2014KYYWF－QN01);河南省高等学校青年骨干教师资助计划(2014GGJS－072);河南中医学院博士科研基金(BSJJ2010－22)

450046河南省郑州市，河南中医学院呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心(王君明，苗明三，张月月，崔瑛)，药学院(王君明，张月月，崔瑛)，分子生物学实验中心(陈玉龙)，基础医学院(李晓冰);郑州澍青医学高等专科学校基础医学部(代永霞);郑州大学化学与分子工程学院(屈凌波)

王君明，450046河南省郑州市，河南中医学院呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心＆药学院;

E－mail:mjw98_2010@163．com

屈凌波，450001河南省郑州市，郑州大学化学与分子工程学院;E－mail:qulingbo@zzu．edu．cn