傅咏梅，黄后楷，张文芳，高永坚，刘勇，梁凤友

（国药集团广东环球制药有限公司，广东 佛山 528305）

金钱草是报春花科植物过路黄Lysimachia christinaeHance的干燥全草，味甘、咸，微寒，归肝、胆、肾、膀胱经，具利湿退黄、利尿通淋、解毒消肿之功，用于湿热黄疸、胆胀胁痛、石淋、热淋、小便涩痛等[1]。研究表明，金钱草的化学成分主要是黄酮和多糖类化合物，其中以槲皮素、山柰素的黄酮苷及苷元为主的成分[2‑6]，具有利尿排石、抗氧化、降低血尿酸水平等广泛的药理作用[7‑9]。

饮片标准汤剂是以中医理论为指导、临床应用为基础，参考现代提取方法，经标准化工艺制备而成的单味中药饮片水煎剂。中药配方颗粒的各项指标及生产过程必须与标准汤剂确定的质量标准相吻合。关于金钱草的基源研究，郭林林等[10]建立了金钱草药材的HPLC指纹图谱，以芦丁为参照峰，确立了金钱草药材指纹图谱中的13个共有峰；方国花[11]建立了正品金钱草药材HPLC‑MS指纹图谱，确定了10个共有峰，并确认出其中3个共有峰的结构。金钱草与广金钱草的鉴别手段主要有基原鉴别、性状鉴别和显微鉴别[12‑13]。林碧珊等[14]使用广金钱草标准汤剂建立的UPLC特征图谱，标定并指认夏佛塔苷、异荭草苷、异夏佛塔苷和异牡荆苷4个化合物用于鉴别金钱草与广金钱草。本研究采用UPLC法建立金钱草标准汤剂特征图谱，标定并指认了山柰酚‑3‑（2，6‑二吡喃鼠李糖基吡喃葡萄糖苷）、山柰酚‑3‑O‑芸香糖苷、槲皮素、山柰素4个化合物用于鉴别金钱草与广金钱草，为全面评价金钱草的质量及其基原鉴别提供了科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

H‑class UPLC高效液相色谱仪（美国Waters公司，PDA二极管阵列检测器）；MS105DU十万分之一天平（瑞士梅特勒‑托利多公司）；AL104万分之一天平（瑞士梅特勒‑托利多公司）；KQ‑500DE超声清洗机（昆山超声仪器有限公司）；HH‑4数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）；MⅠLLⅠPORE Synergy UV超纯水仪（默克公司）。

1.2 试药

山柰酚‑3‑O‑芸香糖苷对照品（批号：112007‑201602）、槲皮素对照品（批号：100081‑201610）、山柰素对照品（批号：110861‑201611）、金钱草对照药材（批号：121187‑201403）由中国食品药品检定研究院提供；山柰酚‑3‑（2，6‑二吡喃鼠李糖基吡喃葡萄糖苷）（批号：M06J9S65081，上海源叶生物有限公司）；甲醇、磷酸均为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3 样品

19批金钱草药材分别从四川、重庆等不同产地购得，经国药集团广东环球制药有限公司质检部黄国满助理工程师按照2020年版《中国药典》金钱草药材检验均符合规定。药材及相关样品具体信息见表1。

表1 19批金钱草药材来源信息Table 1 Ⅰnformation of 19 batches of Lysimachiae Herba

2 方法与结果

2.1 标准汤剂的制备

取金钱草饮片150 g，置5 L电控温煎药壶中，加水煎煮2次，第1次煎煮加12倍量水，浸泡30 min后，先武火煮沸后再文火保持微沸煎煮30 min，用350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第2次煎煮加10倍量水，先武火煮沸后再文火保持微沸煎煮25 min，用350目筛网趁热过滤，滤液迅速冷水冷却，合并2次滤液。将合并后的滤液转移至旋转蒸发仪中浓缩（水浴温度：65℃，真空度：-0.1 MPa），浓缩至约150 g左右，测定含固率，按比例加入纯化水至清膏含固率为15%左右，分装至10 mL西林瓶中，每瓶分装体积为2.5 mL，分装完毕后转移至真空冷冻干燥机中冻干，取出，轧铝盖，即得。

2.2 色谱条件与系统适应性

色谱柱为CORTECS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.6μm）；乙腈为流动相A，0.2%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0~15 min，12%→15%A；15~30 min，15%→35%A；30.1~35 min，12%A）；柱温为30℃；流速为0.20 mL/min；检测波长为364 nm；进样量1µL；理论塔板数按槲皮素峰计算应不低于10 000。

2.3 参照物溶液的制备

取山柰酚‑3‑O‑芸香糖苷对照品、槲皮素对照品和山柰素对照品适量，精密称定，加80%（体积分数，下同）甲醇制成每1 mL各含50μg的溶液，即得。取金钱草对照药材1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇10 mL，称定质量，超声处理20 min，用80%甲醇补足减失的质量，过滤，取续滤液，即得。

2.4 供试品溶液的制备

取本品研细，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇10 mL，称定质量，超声（功率500 W，频率40 kHz）处理20 min，取出，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5 特征图谱分析方法验证

2.5.1 精密度试验 取金钱草标准汤剂（YP18040 10B2）1份，按“2.4”项方法制备供试品溶液，按“2.2”项色谱条件连续进样6次，以槲皮素峰为参照峰，计算各峰与参照峰的相对保留时间及相对峰面积。各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 溶液稳定性试验 取金钱草标准汤剂1份，按“2.4”项方法制备供试品溶液，按“2.2”项色谱条件分别在0、2、4、8、12、16、20、24 h进样检测，以槲皮素峰为参照峰，计算各峰与参照峰的相对保留时间及相对峰面积。各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明供试品液在24 h内稳定性良好。

2.5.3 重复性试验 取同一批金钱草标准汤剂，分别精密称取6份，按“2.4”项方法平行制备供试品溶液，按“2.2”项色谱条件进行测定，以槲皮素为参照峰，计算各峰与参照峰的相对保留时间及相对峰面积。各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2%，表明方法重复性良好。

2.6 特征图谱的建立与分析

2.6.1 特征峰指认 分别吸取“2.3”项对照品溶液和“2.4”项供试品溶液，按“2.2”项色谱条件进样，记录色谱图，见图1。将供试品色谱峰与对照品色谱峰保留时间进行比较，确定供试品图谱中的3号峰为山柰酚‑3‑（2，6‑二吡喃鼠李糖基吡喃葡萄糖苷），5号峰为山柰酚‑3‑O‑芸香糖苷，6号峰为槲皮素，7号峰为山柰素。

图1 对照品与金钱草标准汤剂供试品的图谱Figure 1 Chromatograms of kaempferol‑3‑(2,6‑dirhamnopy‐ranosyl‑glucopyranoside),kaempferol 3‑rutinoside,quercetin,kaempferol references and the sample of standard decoction of Lysimachiae Herba

2.6.2 特征图谱的建立 取S1‑S19符合规定的金钱草、金钱草对照药材，按“2.1”项方法制备19批金钱草标准汤剂样品及金钱草对照药材标准汤剂样品，按“2.4”项方法制备供试品溶液及金钱草对照药材溶液，上述溶液按“2.2”项的色谱条件测定，记录19批金钱草及金钱草对照药材色谱图。采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”对19批金钱草图谱进行分析，选择7个分离度较好的共有色谱峰为特征峰。通过与金钱草对照药材色谱图进行对比，确定3号峰为山柰酚‑3‑（2，6‑二吡喃鼠李糖基吡喃葡萄糖苷），5号峰为山柰酚‑3‑O‑芸香糖苷，6号峰为槲皮素，7号峰为山柰素，结果见图2~图4。

图2 19批金钱草标准汤剂的UPLC叠加图谱Figure 2 UPLC chromatograms of 19 batches of standard decoction of Lysimachiae Herba

图4 19批金钱草标准汤剂UPLC对照图谱Figure 4 UPLC reference chromatogram of 19 batches of standard decoction of Lysimachiae Herba

2.6.3 共有峰相对保留时间和相对峰面积的测定根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》[11]，以槲皮素峰6为参照峰（S峰），计算各共有峰的相对保留时间和各相对峰面积，结果见表2~表3。

表2 19批金钱草的相对保留时间Table 2 Relative retention time of 19 batches of Lysimachiae Herba（n=19）

表3 19批金钱草的相对峰面积Table 3 Relative peak area of 19 batches of Lysimachiae Herba(n=19)

2.6.4 不同产地标准汤剂特征图谱相似度分析 将19批样品的UPLC特征图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，以S1图谱为参照图谱，时间窗设置为0.1，进行峰匹配，计算得到19批金钱草与对照图谱之间的相似度，结果见表4。可见，19批金钱草的相似度均大于0.9，表明不同产地的金钱草药材具有较高的相似性。

表4 19批金钱草的相似度测定结果Table 4 Thesimilarity resultsof 19 batchesof Lysimachiae Herba

图3 金钱草对照药材UPLC图谱Figure 3 UPLCchromatogram of the control medicinal mate‐rial of Lysimachiae Herba

2.7 与混淆品特征图谱的比较

2.7.1 金钱草与小叶金钱草的鉴别比较 小叶金钱草为伞形科植物天胡荽Hydrocotyle sibthorpioidesLam.的干燥全草，已有文献报道天胡荽中含有槲皮素等成分[9]，临床使用上与金钱草均有利湿退黄的功效，容易与金钱草药材混淆。此外，小叶金钱草（批号JQC15~JQC17）依据2020年版《中国药典》中金钱草药材标准检查均符合规定，但通过建立金钱草特征图谱方法可以把二者进行区别。

小叶金钱草的供试品溶液制备：取小叶金钱草按“2.1”项方法制备小叶金钱草标准汤剂样品，按“2.4”项方法制备供试品溶液。

金钱草与小叶金钱草特征图谱比较见图5。可见，峰1、3、5、6、7号特征峰为二者共有峰，2号和4号特征峰为金钱草专属特征峰。因此，金钱草特征图谱中2号和4号特征峰是区别金钱草和小叶金钱草相关特征峰，表明通过本文方法可以进行金钱草药材劣质品的鉴定。

图5 小叶金钱草与金钱草对照药材UPLC图谱的对比图Figure 5 Comparison of UPLC chromatograms of Hydrocotyle sibthorpioides Lam.and the control medicinal material of Lysimachiae Herba

2.7.2 金钱草药材与广金钱草药材的比较 广金钱草为广西和广东地区习用金钱草，为豆科山蚂蝗属广金钱草Desmodium styracifolium（Osb.）Merr.的全草，与金钱草均有利湿退黄、利尿通淋的功效，临床使用上容易与金钱草药材混淆[10]。

广金钱草的供试品溶液制备：取广金钱草按“2.1”项方法制备广金钱草标准汤剂样品，按“2.4”项制备供试品溶液。

金钱草与广金钱草特征图谱比较见图6。可见，金钱草中特征峰3、4、5、6（槲皮素）、7（山柰素）均没有出现在广金钱草特征图谱中；而广金钱草图谱中的与峰6槲皮素相近的保留时间处的色谱峰通过二极管阵列检测器对该色谱峰的紫外吸收图进行对比，与槲皮素并不是同一组分。表明采用本文方法可以将金钱草与广金钱草进行区分。

图6 金钱草和广金钱草特征图谱比较Figure 6 Comparison of chromatograms of Lysimachiae Herba and Desmodium styracifolium（Osb.）Merr.

3 讨论

本品采用二极管阵列对供试品溶液在190~400 nm下进行检测，通过移动波长，发现选取240 nm和310 nm作为检测波长时，各特征色谱峰响应值相差较大且基线不平稳；当选取364 nm作为检测波长时，各峰信号响应值较平均色谱峰分离度较好，基线相比其他波长平稳，参考槲皮素、山柰素的最大吸收波长和香港中药材标准金钱草指纹图谱方法中检测波长为364 nm，因此选择364 nm为金钱草特征图谱检测波长。

参照香港中药材标准中金钱草药材的指纹图谱方法和金钱草标准汤剂含量测定方法，确定了金钱草标准汤剂中参照物成分为槲皮素和山柰素。由于金钱草标准汤剂是经水提取制备而成，大极性成分理论上应是其质量控制的重要内容。通过研究不同产地金钱草标准汤剂的特征图谱，甲醇-0.1%磷酸流动相体系色谱峰较密集，容易造成部分特征峰分离度不佳，影响特征峰的定位分析，进一步筛选色谱流动相体系，选择乙腈-0.2%磷酸体系能对金钱草标准汤剂各组分达到更优的分离效果，具有分析时间短、系统压力较低和峰分离度、纯度较好等优点。

本研究对19批金钱草标准汤剂样品进行相似度评价计算，结果表明19批金钱草的相似度均大于0.90，表明不同产地的金钱草药材具有较高的相似性，产地差异较少。

在中药材品种的发展变迁中，不仅存在着多基原品种现象，导致药材品种混乱、质量难以控制，同时也存在着劣质品掺杂的现象，不同程度地影响着药材质量的安全性、有效性和可控性；本研究初步建立的方法可应用于混淆品广金钱草和小叶金钱草的鉴别，为金钱草药材提供更全面的质量控制方法。