王 勇，王显雷，刘 锐，黄新莉，陈素丽，李卫红

·论著·

硫化氢对脂多糖致急性肺损伤大鼠的保护作用及其作用机制研究

王 勇，王显雷，刘 锐，黄新莉，陈素丽，李卫红

目的 探讨硫化氢(H2S)对脂多糖(LPS)致急性肺损伤(ALI)大鼠的保护作用及其作用机制。方法 选取清洁级健康雄性SD大鼠30只，随机分为对照组、模型组和干预组，每组10只。对照组大鼠给予0.9%氯化钠溶液0.5 ml/kg舌下静脉注射，模型组大鼠给予LPS 5 mg/kg舌下静脉注射，干预组大鼠给予LPS 5 mg/kg舌下静脉注射，并在注射LPS前15 min给予NaHS 28 μmol/kg腹腔注射。检测各组大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)蛋白及白介素10(IL-10)含量、肺组织细胞间黏附分子1(ICAM-1)表达情况。结果 模型组、干预组大鼠BALF蛋白及IL-10含量、肺组织ICAM-1水平高于对照组，干预组大鼠BALF蛋白及IL-10含量、肺组织ICAM-1水平低于模型组(P<0.05)。结论 H2S对LPS致ALI有一定的保护作用，其作用机制可能与降低肺内IL-10含量、减少肺组织ICAM-1表达关。

急性肺损伤；硫化氢；脂多糖；白介素10；细胞间黏附分子1；大鼠，Sprague-Dawley

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是由休克、创伤、严重感染等因素导致的弥漫性肺实质损伤，ALI患者机体内可产生多种炎性递质，同时伴有众多炎性细胞因子和黏附分子的过度表达。ALI致病因素多且病死率高，但目前其发病机制仍未完全阐明[1-3]。研究表明，ALI患者体内中性粒细胞在肺内被激活并聚集，继而释放氧自由基和蛋白水解酶等，导致肺微血管通透性增高；白介素10(IL-10)可能通过抑制气道炎症来延缓ALI的发展；抑制细胞间黏附分子1(ICAM-1)表达可有效减轻ALI患者体内炎性反应[4-7]。

硫化氢(H2S)是继一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)之后被发现的第3种内源性气体信号分子，具有舒张血管、调节血管平滑肌细胞增殖/凋亡等作用[8]。本研究旨在探讨H2S对脂多糖(LPS)致大鼠ALI的保护作用及对肺组织ICAM-1表达的影响，为临床防治ALI提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 NaHS(美国Sigma公司)，LPS(E.coli 0111：B4)，IL-10检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，兔抗ICAM-1多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，石蜡切片机(Leica RM2235，德国Leica公司)，光学显微镜(北京麦克奥迪仪器仪表有限公司)，电子天平(AE240型，日本METTLER)，低温离心机(EBA12R型，德国Hettich公司)，VIS-7220可见分光光度计(北京北分瑞利分析仪器公司)等。

1.2 动物分组及模型制备 选取清洁级健康雄性SD大鼠30只(由河北省实验动物中心提供)，体质量210～240 g，放于笼底覆盖洁净垫料的鼠笼内，并给予充足的饲料和水，笼内温度24 ℃左右，相对湿度40%～60%，适应性饲养3～4 d后随机分为对照组、模型组和干预组，每组10只。对照组大鼠给予0.9%氯化钠溶液0.5 ml/kg舌下静脉注射，模型组大鼠给予LPS 5 mg/kg舌下静脉注射，干预组大鼠给予LPS 5 mg/kg舌下静脉注射，并在注射LPS前15 min给予NaHS 28 μmol/kg腹腔注射。本研究中对所有大鼠进行的操作符合动物实验伦理要求。

1.3 肺组织病理学改变 所有大鼠于造模成功6 h后处死，取部分左肺组织，采用10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片(厚度5 μm)；采用HE染色，于光学显微镜下观察肺组织病理学改变。

1.4 支气管肺泡灌洗液(BALF)蛋白及IL-10含量检测 各组小鼠开胸后结扎左肺，经气管注入预冷0.9%氯化钠溶液5 ml并进行支气管肺泡灌洗，重复3次收集BALF；3 000 r/min离心10min，吸取上清液，采用改良酚试剂法检测BALF蛋白含量；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF IL-10含量。所有检测过程严格按照试剂盒说明书操作。

1.5 肺组织ICAM-1的表达 取各组大鼠部分右肺组织，采用4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片、脱蜡、水化；采用兔抗ICAM-1多克隆抗体(1∶100)作为一抗，37 ℃孵育1.5 h；采用免疫组化染色，以光学显微镜下发现细胞质出现棕黄色颗粒为ICAM-1表达阳性；采用PBS代替一抗作为阴性对照，ICAM-1的表达水平以平均光密度(OD)值表示。

2 结果

2.1 肺组织病理学改变 光学显微镜下观察发现，对照组大鼠肺组织正常，肺泡壁薄；模型组大鼠肺组织严重受损，肺泡间隔增厚，肺间质及肺泡腔内见大量炎性细胞和红细胞浸润；干预组大鼠肺组织损伤程度较轻，肺泡间隔较厚，肺间质及肺泡腔内见少量炎性细胞和红细胞浸润(见图1)。

2.2 BALF蛋白及IL-10含量 3组大鼠BALF蛋白及IL-10含量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；模型组、干预组大鼠BALF蛋白及IL-10含量高于对照组，干预组大鼠BALF蛋白及IL-10含量低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.3 肺组织ICAM-1的表达 光学显微镜下观察发现，对照组大鼠肺组织无或有少量棕黄色颗粒；模型组大鼠肺组织有大量棕黄色颗粒，主要见于气道黏膜上皮细胞和血管内皮细胞；干预组大鼠肺组织有少量棕黄色颗粒(见图2)。3组大鼠肺组织ICAM-1表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组、干预组大鼠肺组织ICAM-1表达水平高于对照组，干预组大鼠肺组织ICAM-1表达水平低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

Table 1 Comparison of protein and IL-10 levels of BALF，ICAM-1 expression of lung tissue among the three groups

组别只数BALF蛋白含量(mg/L)BALFIL-10含量(ng/L)肺组织ICAM-1表达水平(OD值)对照组1032.99±6.8919.64±1.720.16±0.05模型组1094.98±12.95a63.09±11.28a0.36±0.07a干预组1069.71±9.67ab50.72±4.14ab0.26±0.11abF值95.240102.07223.328P值<0.05<0.05<0.05

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

3 讨论

ALI是多种原因引起的、以过度炎性反应和高代谢为特征的急性弥漫性肺泡和肺血管损伤，可发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress sydrome，ARDS)。ALI患者体内多种炎性细胞(如中性粒细胞、肺泡巨噬细胞等)在肺部大量聚集、过度激活，继而释放大量炎性递质或炎性细胞因子，包括TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等，参与炎性反应；同时机体会分泌多种抗炎性细胞因子来维持机体内环境稳定，包括IL-4、IL-10、IL-13等；促炎因子与抗炎因子严重失衡将进一步放大和加强损害信号，继而形成炎症瀑布效应，导致肺泡弥漫性损害、毛细血管通透性增高、蛋白渗出、肺间质水肿等[9-10]。研究表明，造成ALI 的主要病因是细菌内毒素，其中以革兰阴性菌内毒素为主，而革兰阴性菌内毒素的主要活性成分为LPS。本研究通过舌下静脉注射LPS 5 mg/kg制备ALI大鼠模型，6 h后处死，光学显微镜下观察发现模型组大鼠肺组织严重受损，肺泡间隔增厚，肺间质及肺泡腔内见大量炎性细胞和红细胞浸润，BALF蛋白含量高于对照组，说明采用舌下静脉注射LPS成功制备了ALI大鼠模型。

注：A为对照组，B为模型组，C为干预组

图1 3组大鼠肺组织病理学改变(HE染色，×400)

Figure 1 Pathological changes of lung tissue among the three groups

注：A为对照组，B为模型组，C为干预组

H2S是具有多种生物学效应的第3种内源性气体信号分子，不仅可在生理条件下参与机体调节活动，还可参与多种疾病的病理过程。内源性H2S主要由含硫氨基酸(L-半胱氨酸)经多种酶促反应产生，在体内以2种形式存在，即未溶解的气体H2S(约占1/3)和NaHS(约占2/3)。NaHS是常用的外源性H2S供体，其在体内可分解为Na+和HS-，后者与体内H+结合可生成H2S，正常生理条件下，体内H2S与NaHS保持动态平衡[11]。研究表明，H2S在多种肺疾病，如慢性阻塞性肺疾病、肺炎症性损伤及肺纤维化等的发生、发展过程中发挥着重要的调节作用，肺疾病患者体内H2S含量低于健康人[12-16]，给予H2S供体NaHS或吸入低剂量H2S能够明显改善患者肺组织损伤严重程度[17-18]。由于NaHS溶液稳定性较好，因此常作为H2S供体而用于相关干预实验[4]。本研究结果显示，干预组大鼠肺组织损伤程度较轻，肺泡间隔较厚，肺间质及肺泡腔内见少量炎性细胞和红细胞浸润，BALF蛋白含量低于模型组,提示H2S可有效减轻ALI大鼠炎性反应程度，降低肺微血管通透性，减少蛋白渗出，从而保护肺组织。

研究表明，ALI患者体内细胞因子大量释放，促炎因子与抗炎因子同时存在，而促炎因子与抗炎因子失衡是导致ALI加重并发展为ARDS的重要作用机制之一。IL-10又称细胞因子合成抑制因子，是一种内源性抗炎因子，主要由T细胞、B细胞和巨噬细胞产生，对免疫应答起抑制作用。研究表明，IL-10是肺内重要的内源性调节因子，在维持肺稳态和抗炎调节中发挥着至关重要的作用，IL-10主要通过抑制JAK/STAT信号通路和NF-κB信号通路而发挥强大的抗炎作用和免疫抑制作用[19-21]。本研究结果显示，模型组、干预组大鼠BALF IL-10含量高于对照组，干预组大鼠BALF IL-10含量低于模型组，说明IL-10参与了ALI的发生、发展，H2S可能通过降低IL-10含量而纠正体内促炎与抗炎因子的失衡，减轻炎性反应严重程度。

ICAM-1是介导中性粒细胞参与肺损伤的分子物质，在ALI的发生、发展过程中发挥着重要作用，可作为肺血管内皮细胞活化的生物学标志物，而抑制ICAM-1的表达能有效缓解ALI患者体内氧化应激损伤[22-24]。本研究结果显示，模型组大鼠肺组织有大量棕黄色颗粒，且主要见于气道黏膜上皮细胞和血管内皮细胞，而干预组大鼠肺组织仅有少量棕黄色颗粒；模型组、干预组大鼠肺组织ICAM-1表达水平高于对照组，干预组大鼠肺组织ICAM-1表达水平低于模型组，提示H2S可能通过减少肺组织ICAM-1的表达而发挥抗ALI作用。

综上所述，H2S对LPS致ALI大鼠有一定的保护作用，其可能通过降低肺内IL-10含量、减少肺组织ICAM-1表达而减轻肺泡-毛细血管损伤及减少蛋白渗出，从而抑制炎性反应，发挥抗ALI作用，有效保护肺组织。

[1]罗康.脂多糖诱导大鼠急性肺损伤的机制研究进展[J].临床合理用药，2014，7(2B)：166-167.

[2]王大龙，冷玉芳.二硫代氨基吡咯烷对大鼠急性肺损伤保护作用[J].医药导报，2014，33(3)：307-310.

[3]向红，王雅莉，邱桐，等.红芪水提物对急性肺损伤模型大鼠的保护作用[J].中国药房，2014，25(15)：1352-1354.

[4]黄新莉，周晓红，周君琳，等.中性粒细胞在外源性硫化氢抗内毒素致急性肺损伤中的作用[J].生理学报，2009，61(4)：356-360.

[5]陈宇清，荣令，周新.三七总皂苷对急性肺损伤大鼠血清和支气管肺泡灌洗液肿瘤坏死因子α、白介素6和白介素10水平的影响[J].实用心脑肺血管病杂志，2013，21(2)：89-92.

[6]张智，高磊，丁春华，等.褪黑素对油酸致大鼠急性肺损伤的防护作用及其机制研究[J].中国应用生理学杂志，2011，27(4)：480-483.

[7]代庆春，李冬梅，周晓红，等.硫化氢对内毒素攻击大鼠肺组织细胞凋亡的影响及肺保护作用[J].临床荟萃，2012，27(16)：1406-1410.

[9]Matthay MA，Zemans RL.The acute respiratory distress syndrome：pathogenesis and treatment[J].Annu Rev Pathol，2011，6(1)：147-163.

[10]Lee WL，Downey GP.Neutrophil activation and acute lung injury[J].Curr Opin Crit Care，2001，7(1)：1-7.

[11]Wang R.Two′s company，three′s a crowd：can H2S be the third endogenous gaseous transmitter？[J].FASEB J，2002，16(13)：1792-1798.

[12]Chen YH，Yao WZ，Geng B，et al.Endogenous hydrogen sulfide in patients with COPD[J].Chest，2005，128(5)：3205-3211.

[13]Chen YH，Yao WZ，Ding YL，et al.Effect of theophylline on endogenous hydrogen sulfide production in patients with COPD[J].Pulm Pharmacol Ther，2008，21(1)：40-46.

[14]Sowmya S，Swathi Y，Yeo AL，et al.Hydrogen sulfide：regulatory role on blood pressure in hyperhomocysteinemia[J].Vascul Pharmacol，2010，53(3/4)：138-143.

[15]Tamizhselvi R，Moore PK，Bhatia M.Inhibition of hydrogen sulfide synthesis attenuates chemokine production and protects mice against acute pancreatitis and associated lung injury[J].Pancreas，2008，36(4)：e24-e31.

[16]Chen YH，Yao WZ，Gao JZ，et al.Serum hydrogen sulfide as a novel marker predicting bacterial involvement in patients with community-acquired lower respiratory tract infections[J].Respirology，2009，14(5)：746-752.

[17]Wang P，Zhang JX，Gong JP，et al.Effects of hydrogen sulfide on pulmonary surfactant in rats with acute lung injury induced by lipopolysccharide[J].Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi，2011，27(4)：485-489.

[18]Faller S，Zimmermann KK，Strosing KM，et al.Inhaled hydrogen sulfide protects against lipopolysaccharide induced acute lung injury in mice[J].Med Gas Res，2012，2(1)：26.

[19]孙荣青，张少雷.脓毒症早期血清白细胞介素-18和10在疾病严重程度及预后评估中的价值研究[J].中国危重病急救医学，2011，23(5)：299-301.

[20]钟梓文，曾思，兰志勋.急性肺损伤时白细胞介素10在肺泡巨噬细胞中的表达[J].医学综述，2013，19(9)：1555-1558.

[21]王刚，李来传，史有奎，等.地塞米松对急性肺损伤患者血浆和支气管肺泡灌洗液APN、TNF-α、IL-10水平的影响[J].山东医药，2015，55(16)：65-66.

[22]Gerbitz A，Ewing P，Olkiewicz K，et al.A role for CD54(intercellular adhesion molecule-1)in leukocyte recruitment to the lung during the development of experimental idiopathic pneumonia syndrome[J].Transplantation，2005，79(5)：536-542.

[23]Laudes IJ，Guo RF，Riedemann NC，et al.Disturbed homeostasis of lung intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 during sepsis[J].Am J Pathol，2004，164(4)：1435-1445.

[24]姜娜，杨玉洁.银杏叶提取物抑制大鼠急性肺损伤时ICAM-1蛋白的表达[J].内蒙古医学杂志，2012，44(5)：517-520，封4.

(本文编辑：鹿飞飞)

Protective Effect of Hydrogen Sulfide on LPS-induced Acute Lung Injury in Rats and Its Mechanism

WANGYong，WANGXian-lei，LIURui，etal.

DepartmentofTuberculosis，ChestHospitalofHebeiProvince，Shijiazhuang050041，China

Objective To investigate the protective effect of hydrogen sulfide on LPS-induced acute lung injury in rats and its mechanism.Methods A total of 30 clean healthy male SD rats were selected and randomly divided into groups A，B，C，each of 10 rats.Rats of A group were given sublingual venous injection of 0.9% sodium chloride injection(0.5 ml/kg)，rats of B group were given sublingual venous injection of LPS(5 mg/kg)，rats of C group were given intraperitoneal injection of NaHS 28 μmol/kg before 15 minutes of sublingual venous injection of LPS(5 mg/kg).Protein level and IL-10 level of BALF，ICAM-1 level of lung tissue were detected.Results Protein level and IL-10 level of BALF，ICAM-1 level of lung tissue of groups B and C were statistically significantly higher than those of A group，and above index of C group were statistically significantly lower than those of B group(P<0.05).Conclusion Hydrogen sulfide has certain protective effect on LPS-induced acute lung injury，its mechanism is possibly related with decreasing of IL-10 level and ICAM-1 expression.

Acute lung injury；Hydrogen sulfie；Lipopolysaccharides；Interleukin-10；Intercellular adhesion molecule-1；Rats，Sprague-Dawley

河北省卫生计生委指导性课题(20130436)

050041河北省石家庄市，河北省胸科医院结核内科(王勇，王显雷，刘锐，陈素丽，李卫红)；河北医科大学病理生理教研室(黄新莉)

王勇.王显雷，刘锐，等.硫化氢对脂多糖致急性肺损伤大鼠的保护作用及其作用机制研究[J].实用心脑肺血管病杂志，2015，23(8)：43-46.[www.syxnf.net]

R 332 R 563

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.08.013

2015-03-10；

2015-06-13)

Wang Y，Wang XL，Liu R，et al.Protective effect of hydrogen sulfide on LPS-induced acute lung injury in rats and its mechanism[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(8)：43-46.