杨桂英，吴敬涛

(1.济南大学图书馆;2.济南大学学报编辑部(自然科学版)，山东济南250022)

桔梗皂苷对高胆固醇血大鼠低密度脂蛋白受体的调节

杨桂英1，吴敬涛2

(1.济南大学图书馆;2.济南大学学报编辑部(自然科学版)，山东济南250022)

以高脂乳剂诱导高胆固醇血大鼠模型，研究肝脏胆固醇代谢相关的低密度脂蛋白受体(LDL－r)的活性.灌喂SD大鼠高脂乳剂饮食42d，建立高胆固醇血模型;随机将高胆固醇血大鼠分成4组:空白组、高脂组、低皂苷剂量组、高皂苷剂量组，分别按每千克体质量30、100 mg给以桔梗皂苷降胆固醇，连续21d;分别利用免疫组织化学方法和免疫印迹方法检测LDL－r的蛋白变化，利用PCR方法检测LDL－r基因表达水平.结果表明，低、高剂量桔梗皂苷均能显著降低(P＜0.01)高脂乳剂诱导的高胆固醇血大鼠的LDL－r，提示桔梗皂苷降低血胆固醇的作用是通过LDL－r转运胆固醇的作用实现的.

桔梗;皂苷;低密度脂蛋白受体;低密度脂蛋白;胆固醇

低密度脂蛋白胆固醇(LDL－C)在心血管疾病发病过程中起到重要作用［1］.低密度脂蛋白受体(LDL－r)的约50%以上位于肝细胞膜，其含量和活性是LDL－C代谢的关键因素，抑制LDL－r活性是导致高胆固醇血症的重要原因，且胆固醇代谢的LDL－r途径，是血清中胆固醇代谢的主要途径［2－3］.LDL－r途径表现为LDL－r先与LDL－C结合，将胞外LDL－C跨膜至胞内，进一步进行生化反应［4］.

降血脂药物能有效调节LDL－r的活性和表达，相同的研究也证实，多种传统中草药也能够调节LDL－r活性或降低和减少LDL－C浓度［5－6］.研究证实，桔梗是一种药食两用资源，其中所含皂苷D具有降低胆固醇的作用［7－9］.基于上述认识，本文中利用桔梗提取物桔梗皂苷，建立高胆固醇血大鼠，在蛋白和基因水平上检测肝细胞LDL－r活性和表达水平，以期明确桔梗皂苷肝组织内调节胆固醇的药理.

1 实验

1.1 材料试剂与仪器设备

雄性大鼠SD 60只，体质量250g左右，购于山东大学实验动物中心;桔梗皂苷，自提;LDL－r免疫组织化学试剂盒，武汉博士德;牛血清白蛋白(BSA)、蛋白定量试剂盒，Sigma;PCR试剂，日本TaKaRa.

Leica－cm3050s冰冻切片机，德国.Cx51Olympus光学显微镜，日本.5804REppendorf冷冻离心机和Primus 96 Plus PCR仪，德国.HMIAS－2000医学彩色图像分析系统，千屏影像.

1.2 方法

1.2.1 动物造模及分组

SD大鼠45只，高脂乳剂饮食灌胃，每天5mL，42d，测定生化指标，建立高胆固醇模型.高脂乳剂成分为胆固醇100g、大油250g、硫氧嘧啶10g、吐温250mL、丙二醇200mL、胆酸钠20g、蒸馏水300mL.

随机将SD大鼠分成4组，每组10只:空白组、模型组、低皂苷剂量组、高皂苷剂量组.每日低、高皂苷剂量组分别按每千克体质量30和100 mg皂苷给药，空白组、模型组以同体积生理盐水灌胃，连续21d.

1.2.2 冰冻切片制作

取药物处理21d后的大鼠，麻醉，处死，取出肝组织，修剪成5mm3方块，入－80℃液氮.调节切片机温度为－20℃，置肝组织块于支承器，周边滴包埋剂，转置冷冻台，冰冻并修平.切片厚度为6μm.

1.2.3 免疫组织化学

以10%甲醛固定冰冻切片，H2O2和甲醇混合液温室孵育30min，后以BSA孵育.先后滴加PBS液、按1:300体积比稀释的兔抗鼠LDL－r抗体，37℃孵育1h;羊抗鼠IgG，30℃孵育20min;滴加SABC，25℃孵育15min.滴加显色液，洗片.每组显色切片置400倍显微镜观察，采集图像(图1).测定黄色的阳性表达的低密度脂蛋白受体.

1.2.4 免疫印迹

制备肝微粒体，测定其中的总蛋白质含量.蛋白行凝胶电泳，转置聚偏二氟乙烯膜，封闭1.8 h(脱脂奶粉，质量比为4.8%)，按体积比1∶1000加入羊抗人LDL－r抗体，4℃孵育，次日Tris－HCl缓冲盐溶液(Tween)(TBST)洗膜，加辣根过氧化物酶标记的二抗(体积比为1∶2000)，孵育1h，TBST液再次洗膜并显影，测定积分光密度值，内参β－actin蛋白.

图1 皂苷对肝脏LDL－r蛋白表达水平的免疫组化结果(×400)

1.2.5 PCR

提取肝组织总RNA，检测完整性与纯度.反转录DNA，滴加DEPC水、RNA、oligo(dt)混合，水浴，冰浴，后依次加入5×Buffer、dNTP、RNase抑制剂、反转录酶、DEPC水，水浴，95℃反应5min终止.

大鼠LDL－r的基因序列来源于美国国立生物技术信息中心(NCBI).稀释引物，反应体系为:PCR缓冲液2.5μL、2mmol dNTP混合物0.5μL、DNA聚合酶0.5μL、LDL－r正向引物0.5μL、LDL－r反向引物0.5μL、GADPH正向引物0.4μL、GADPH反向引物0.4μL、四酰胺0.5μL、cDNA1.5μL、无菌水17.7μL，首轮循环变性90℃3.5min;后续35个循环，变性90℃45sec，退火50℃30sec，延伸71℃70sec，73℃10min.琼脂糖电泳分析，对上述图像进行灰度值分析，进行量化.

1.3 数据统计处理

以13th SPSS处理实验数据，具有统计学意义的差异为P＜0.05，One－way ANOVA决定差异显著性，以平均值形式表示.

2 结果

2.1 肝组织LDL－r表达水平

免疫组化结果见图1，从图中可看出，模型组大鼠肝脏组织的免疫组织化学检测结果中黄色染色区域明显低于空白组，说明LDL－r的表达高，皂苷2组染色区域明显高于模型组(P＜0.01).表明2种浓度的皂苷处理高胆固醇血大鼠，其肝脏LDL－r蛋白表达水平不同程度的被降低.

利用图像分析系统对图1的免疫组给图进行灰度值分析，每组求出的平均值，代表每组LDL－r蛋白表达水平，结果见图2.

图2 皂苷对肝脏LDL－r蛋白表达水平的免疫组化结果分析(图中#表示与空白组相比P＜0.01，*表示与空白组相比P＜0.01)

从图2中可看出，模型组大鼠肝脏组织LDL－r蛋折的表达量显著降低(P＜0.01)，为空白组的42%，而皂苷2组LDL－r蛋白的表达水平分别为72%和89%，显著高于模型组(P＜0.01).表明2种浓度的皂苷能改变高胆固醇大鼠肝脏LDL－r蛋白的表达.

肝脏细胞LDL－r的免疫印迹反应结果的灰度分析见图3.

由图3可以看出，与空白组对比，模型组显著地(P＜0.01)降低了LDL－r蛋白的表达，而其升高，又能被皂苷组显著(P＜0.01)地降低.结果同上.

2.2 肝脏LDL－r基因表达

琼脂糖凝胶电泳和核酸检测结果说明提取的LDL－r RNA纯度满足分子生物学实验的要求.紫外灯照射PCR凝胶，并拍下图片，利用图像分析系统分析图片灰度值，反映LDL－r RNA的表达水平，结果见图4.

图3 皂苷对肝脏LDL－r蛋白表达水平的免疫印迹结果分析

图4 皂苷对肝脏LDL－r蛋白表达水平的免疫印迹结果分析

从图4中可以看出，与空白组对比，高胆固醇血大鼠的LDL－r在基因水平上的表达会显著(P＜0.01)下降，为空白组的29.8%左右，灌胃皂苷处理后发现，皂苷能显著升高(P＜0.01)高胆固醇血大鼠的LDL－r在基因水平，低、高皂苷组分别提升40.1%和52.3%.

3 结论

低密度脂蛋白胆固醇受体LDL－r为肝细胞跨膜糖蛋白，与低密度脂蛋白胆固醇LDL－C结合，转运胆固醇至细胞内，从而清除血清胆固醇，调节体内胆固醇水平.本文中高胆固醇血大鼠肝组织LDL－r蛋白和基因高表达水平，被每千克体质量30和50mg的桔梗皂苷处理后，能显著地降低(P＜0.01)，说明桔梗皂苷降低体内胆固醇的作用，是通过LDL－r途径，提示其为桔梗皂苷降低胆固醇的药理之一.

［1］Ren S，Shen G X.Impact of antioxidants and HDL on glycated LDL－induced generation of fibrinolytic regulators from vascular endothelial cells［J］.Arteriosclerosis Thrombosis＆Vascular Biology，2000，20(6):1688－1693.

［2］Yokozawa T，Cho E J，Sasaki S，et al.The protective role of Chinese prescription Kangen－karyu extract on diet－induced hypercholesterolemia in rats［J］.Biological＆Pharmaceutical Bulletin，2006，29(4):760－765.

［3］Lieu HD，Withycombe SK，Walker Q，et al.Eliminating atherogenesis in mice by switching off hepatic lipoprotein secretion［J］.Circulation，2003，107(9):315－321.

［4］Patalay M，Lofgren I E，Freake H C，et al.The lowering of plasma lipids following a weight reduction program is related to increased expression of the LDL receptor and lipoprotein lipase［J］.Journal of Nutrition，2005，135(4):735－739.

［5］Meddings J B，Spady D K，Dietschy J M.Kinetic characteristics and mechanisms of regulation of receptor－dependent and receptor－independent LDL transport in the liver of different animal species and humans［J］.American Heart Journal，1987，113(2Pt2):475–481.

［6］Fukushima M，Nakano M，Morii Y，et al.Hepatic LDL receptor mRNA in rats is increased by dietary mushroom(Agaricus bisporus)fiber and sugar beet fiber［J］.Journal of Nutrition，2000，130(9):2151－2156.

［7］吴敬涛，范涛，汤卫东，等.桔梗保健茶品的研制［J］.济南大学学报(自然科学版)，2010，26(4):368－371.

［8］Hai L Z，Cho K H，Ha Y W，et al.Cholesterol－lowering effect of platycodin D in hypercholesterolemic ICR mice［J］.European Journal of Pharmacology，2006，537(1－3):166－173.

［9］Sudhop T，Bergmann K V.Cholesterol Absorption Inhibitors for the Treatment of Hypercholesterolaemia［J］.Drugs，2002，62(16):2333－2347.

Regulation of PlatycodonGrandiflorumSaponin on Low Density Lipoprotein Receptor in High Blood Cholesterol Rats

YANG Gui－ying1，WU Jing－tao2
(1.Library of Jinan University;2.Editorial Office of Journal of Jinan University(Science and Technology)，Jinan，250022，China)

The high cholesterol blood model of the rats induced by high fat emulsion was established to study the activity of platycodongrandiflorumsaponin on cholesterol metabolism－related low density lipoprotein receptor(LDL－r)in liver.After SD rats were fed foods with high fat emulsion 42 d，high cholesterol blood model was set up.Random，high cholesterol blood rats were divided into 4 groups:Blank group，High fat and Low saponin dose group.Respectively，according to 30 or 100 mg of saponin per kilogram of body to drop cholesterol，continuous 21 d.Immunohistochemical method and Western blot method to detect changes of LDL－rprotein expression levels in liver，Polymerase chain reaction(PCR)to detect of LDL－r gene expression levels were used.The results show that the low and high dose of saponin can significantly(P＜0.01)reduce the LDL－r of high cholesterol blood rats induced by high fat emulsion，which prompt that the action of platycodongrandiflorumsaponin on highcholesterol blood rats can be come true is the modulatory role of LDL－r transporting cholesterol.

platycodongrandiflorum;saponin;low density lipoprotein receptor;low density lipoprotein; cholesterol

R285

A

1672－2590(2015)06－0104－05

2015－09－29

济南大学博士基金项目(XBS1321)

杨桂英(1976－)，女，山东金乡人，济南大学图书馆馆员.