郭怀攀　佘文琴

摘要 对叶绿体SOD的遗传分类、转录调控过程以及SOD在叶绿体中的功能进行综述分析。叶绿体SOD的转录表达与铜分子伴侣（CCS）及Cu离子浓度密切相关。不同Cu离子浓度能够使不同类型SOD在叶绿体中选择性表达；在植物叶绿体中，SOD还可以进行电子传递、调节电子转移以及保护光合作用等。研究SOD缺失突变体及超表达对植物的影响，对分析SOD的功能具有重要意义。

关键词：超氧化物歧化酶；活性氧；胁迫；叶绿体

中图分类号：S184 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）08-381-04

植物体在自然状态下和各种生物胁迫时均会有活性氧（ROS）产生。植物体自身有着较完善的抑制活性氧产生和活性氧清除机制，能够有效地清除活性氧。而在复杂的自然环境中，植物体可能会受到干旱、盐渍、高温、冷冻、重金属离子、空气污染、病虫害等逆境胁迫，此时机体内会产生大量的活性氧。由于植物体内活性氧代谢能力有限，活性氧积累，从而产生氧化胁迫。在植物体内，超氧化物歧化酶（SOD）在对抗活性氧对细胞膜透性的破坏与保护细胞膜完整性方面有着重要作用。SOD作为活性氧代谢的首要防线，参与O-2等超氧阴离子转化成O2和H2O2的分解反应[1]。然后，在过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）以及抗坏血酸过氧化物酶（APX）等的协同作用下，活性氧完全分解。

SOD在植物体内普遍存在，几乎在所有需氧生物体内都有发现。SOD是一种多聚体金属蛋白。根据酶活性中心金属辅基的不同，可分为Cu/Zn SOD（CSD），Fe SOD（FSD），Mn SOD（MSD）和Ni SOD（NSD）4类。 绿色植物SOD主要包括前3种；Ni SOD被发现较晚，主要存在于一些低等生物中，在植物中尚没有被发现[2]。从遗传进化关系上，FSD是最为原始的SOD，黄褐色，分子结构为四聚体结构，分子量80～90 kDa，在酶活性中心有2～4个Fe离子[3]；MSD与FSD在一级、二级和三级结构上高度相似，金属结合位点的保守残基相同[4]，被认为可能由FSD进化而来，不同的是其活性中心只有一个金属离子，颜色为紫红色；CSD与前两种SOD差异较大，可能是单独进化而来，为二聚体结构，分子量32～65 kDa，颜色也为紫红色[3]。植物自身防护机制限制了有害物质在不同细胞器之间的运输，带电的O-2离子无法通过细胞质膜。这就要求SOD分布在不同细胞器间隔中进行活性氧清除，保护各细胞器代谢不受O-2离子的危害[3]。大量的研究表明，CSD 是分布较广泛也是最主要的一种，位于植物细胞质、叶绿体、过氧化物酶体、乙醛酸循环体以及胞外间隙；FSD主要位于叶绿体中；MSD则位于线粒体基质和过氧化物酶体中[5-6]。植物通过各种细胞器间SOD酶的广泛分布以及与其他酶的协同作用来共同确保植物细胞膜的完整性。

1 植物SOD基因克隆与遗传进化关系

1.1 植物SOD基因的分子克隆 植物SOD基因的克隆开始于20世纪80年代。早期的一些克隆主要有玉米、拟南芥、水稻等。随着分子生物学技术的迅速发展，人们对SOD基因克隆及转化表达工作已进行了大量研究，每年都有上千条SOD基因得到克隆验证。在NCBI数据库中，在Nucleotide中搜索“superoxide dismutase”，已登录的SOD核酸序列（mRNA）就有十多万条，主要是细菌和原核生物，其中绿色植物仅2 583条，绿色植物的克隆中绝大多数是有花植物。植物SOD基因的克隆为植物抗逆性等基因工程研究奠定了基础。植物SOD基因家族的多态性可能是由植物体对于复杂环境的应对机制引起的，不同类型的SOD在抵御逆境时扮演着不同角色[5]。与其他物种相比，植物体SOD基因种类较多，由多个基因分别编码，编码方式相对复杂。各种SOD在亚细胞中的定位不同，对应的基因编码序列也不一样，并且同一亚细胞中也会存在多种SOD，如叶绿体中就同时存在CSD和FSD。植物体内SOD序列具有很高的同源性，且相较于其他生物，SOD基因内含子数目与位置具有高度保守性。在内含子数量上，植物体内核基因组中质胞型CSD的内含子有7个[7]；叶绿体型的有8个，玉米叶绿体型CSD内含子略有不同，只有7个[7]；MSD基因一般含5个内含子[8]，FSD内含子为6～8个[9]。

1.2 SOD遗传进化关系 植物SOD基因家族具有多态性，可能是由植物体对于复杂环境的应对机制引起的。不同类型的SOD在抵御逆境中扮演着不同角色。与其他物种相比，植物体SOD基因的编码方式相对复杂，由多个基因编码。在各种SOD在亚细胞中的定位不同，对应的基因编码序列也不一样。通过对来自23个物种的SOD不同类型基因序列（图1）的比对，发现各类型SOD在不同的植物间具有很高的保守性；FSD与MSD序列相对接近，具有共同进化来源，而CSD与它们的亲缘关系较远，不同亚细胞分布的CSD之间的差异并不明显，如叶绿体CSD中三角叶杨CSD序列与质胞型的欧洲山杨CSD序列比较接近。

2 叶绿体SOD的表达与调控

2.1 叶绿体SOD基因的转录过程 所有植物的SOD基因序列都是由细胞核基因组编码的，因此这些由80S核糖体转录合成的蛋白质需要经过跨膜运输来送达叶绿体。植物叶绿体中主要存在CSD和FSD 2种SOD。在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶绿体中主要是FSD1、FSD2、FSD3和CSD2，其中FSD1的表达量最高。在叶绿体SOD基因的翻译表达过程中，除FSD1外，其他SOD有专一的可分裂的叶绿体转运序列，可以结合SOD经TOC/TIC通道蛋白穿过细胞器膜，最终将SOD运送到叶绿体基质中[10]。紧接着，叶绿体基质中的蛋白酶使得叶绿体转运序列分裂释放SOD，完成SOD的运输过程。Jarvis[10]认为，TOC/TIC通道蛋白具有很强的解折叠能力，推测被结合的SOD应该处于伸展状态。因此，SOD酶的折叠加工与金属辅基的装配过程应该在基质中进行。而FSD酶络合Fe离子的过程尚不明确。铜分子伴侣（Chaperone for Cu/Zn Superoxide dismutase，CCS）在CSD的合成过程中起到传递铜离子的作用，其氨基末端具有铜离子结合位点，中心区域与其靶蛋白CSD酶相似，并且具有额外的半胱氨酸残基的羧基末端结构域，使得铜离子与CSD亚基之间通过二硫键相连，从而激活CSD酶的活性[11]。然而，FSD1作为拟南芥叶绿体SOD中最重要的一种，缺少一个相应的转运序列[12]，FSD1的转运过程以及之后的进一步修饰也有待进一步的研究。

2.2 Cu离子对叶绿体SOD表达的调控 铜离子调节机理的研究已经十分深入，主要涉及转录调控因子启动子结合蛋白SPL7。SPL7是在植物中的Cu响应转录因子[13]，其功能是在植物体内调节Cu离子的平衡。在低Cu离子浓度下，SPL7直接与小RNAmiR398启动子的GTAC序列结合，激活miR398表达[13]。miR398能够降解编码CSD的mRNA，从而抑制CSD的表达。同时，Cu离子还是CSD和铜分子伴侣CCS不可缺少的金属辅基。在高的Cu离子浓度下，CSD大量表达，FSD表达几乎完全被抑制[14]，可能是植物将Fe离子用在其他物质的合成；在低的Cu离子浓度下，CSD和CCS的表达被抑制，FSD的活性被激活[15]，同时Cu离子被优先靶向转移到类囊体内腔中合成质体蓝素[16]。这说明Cu离子对不同类型SOD在叶绿体中的表达具有选择性。外源Cu离子对转CSD、CCS基因的拟南芥突变体中FSD和CSD转录水平的影响进一步表明，叶绿体基质中的铜离子含量调节这些核基因的表达[17]。因此，植物叶绿体中可能存在一种信号途径来感知Cu离子浓度，从而影响植物细胞核中SOD基因的表达。

2.3 胁迫对SOD基因表达的影响 拟南芥叶绿体SOD在各个生长发育阶段均保持着较高的表达水平[12]。这说明叶绿体型SOD在SOD基因家族中扮演着重要角色。在不同的胁迫处理下CSD和FSD的表达情况已有较多的研究。主要是外源金属离子胁迫如Cu、Fe、Zn、As、Mn等离子[18]，光照胁迫如弱光、紫外光[19]，温度胁迫如高温、低温[20]，环境胁迫如干旱、盐渍[21]，还有外源激素处理如ABA、GA3等[22]。干旱、渗透胁迫和外源ABA都会引起叶绿体基质的闭合，影响光合作用中CO2的输送，在光照条件下基质中的光化还原反应过度还原，从而积累大量的过氧化物质[23]。大多数植物位于上述胁迫环境下都会引起SOD的上调表达。这显然与SOD的活性氧清除功能有关。大多数处理[24-26]对叶绿体CSD和质胞CSD的表达影响基本上是一致的，表现为同时上调表达，少数情况[27]表现为同时下调。而胁迫对FSD表达的影响不甚相同，在有些情况下为上调，有时为下调表达，FSD的表达机理有待明确[22]。一些外源物质可以引起SOD基因的差异表达，如盐胁迫条件下水稻幼苗CSD、MSD等抗氧化酶基因表达量增加，但在外源脯氨酸和海藻糖的作用下使这些基因表达量下调，甚至低于没有进行胁迫处理的幼苗[28]。SOD在金属离子产生的过氧化胁迫中起着重要作用[29]。锰离子的毒害作用在短期内可以使得黑麦草不同亚型SOD基因产生差异性表达，就整体而言表达量趋势是上升的[30]。

3 叶绿体SOD功能

叶绿体SOD在植物光合作用过程中起着重要作用，主要是活性氧的清除，可以进行电子传递保护正常光合作用以及调节电子转移与信号传递的作用。

3.1 活性氧的清除 叶绿体是植物进行光合作用的重要场所。在叶绿体中类囊体中，光系统Ⅰ（PSⅠ）和光系统Ⅱ（PSⅡ）反应中心是活性氧的主要生成部位。早在1951年，Mehler[31]就发现了PSⅠ光化还原反应将O2转化成H2O2的反应过程。光合作用的原初光化学反应与一系列的氧化还原反应相衔接。

2H2O→4e-+O2+4H+（PSII）

2O2 +2e- →2O-2（PSI）

2O2-+2H+→2H2O2+O2（SOD）

H2O2 +AsA→2H2O+MDA（APX）

这一系列由光化还原反应产生的电子的传递过程，起始物和终止物都有水的存在，因此被称为W-W循环（Water-water cycle）[32]。W-W循环起到激能传递的作用，同时能够使得光化还原反应中产生的活性氧得以有效清除。PSⅠ反应中心复合物是由多个膜蛋白组成的超分子复合物，将电子传递给H2O形成超氧阴离子[33]，PSⅡ和质体醌同样会产生活性氧[23]。植物叶绿体中存在超过20种Fe-S蛋白[34]，而PSⅠ是还原铁硫中心的光系统，其中心为Fe-S簇。有研究表明，其复合物蛋白中的Fe-S簇对过氧化物高度敏感，易使其功能丧失[34]，同时具有类似结构的FSD1也有可能会丧失酶活性[22]。类囊体外膜的表面被认为是超氧化物产生的主要位置，用免疫标记电子显微镜观察发现大多数叶绿体的CSD紧密地靠近类囊体外膜的表面，与PSⅠ相接近，可能是由于CSD靠近PSⅠ光反应位点会更有效地将活性氧清除[35]。

3.2 保护光合作用与电子传递 植物体自身存在一系列光系统保护体系。在叶绿体中，光合作用中的光系统Ⅱ（PSⅡ）易受到光化还原过程中过多激发能的刺激而产生光抑制作用[36]，影响植物正常的光合作用。在高光或高CO2浓度条件下，W-W循环并不能够有效地转移激发能，此时非光化学猝灭（NPQ）和光呼吸过程可能更有效[23]。W-W循环并非电子传递的主要方式。有研究表明，在正常的光合作用条件下，W-W循环电子传输估计值不到总电子传输量的10%[23]。然而，超表达的FSD在线粒体中会使通过W-W循环传输电子量显著增加，尤其在强光与低温环境条件下[37]。在烟草中，FSD的超表达会改善除草剂甲基紫精处理引起的光抑制作用[38]，在拟南芥中FSD2/FSD3的超表达也具有同样的效果[12]。SOD在保护光合作用中起到的作用是有限的，对拟南芥CSD2的mRNA进行修饰表达使其成为抗miR398，从而提高其表达量。通过观察拟南芥在高光、重金属以及甲基紫精处理下CSD2的表达情况，了解其抗胁迫的能力，结果只有在相对苛刻的处理条件下才能观察到处理与对照之间的差异[39]。

3.3 SOD功能缺失对植物的影响 值得探讨的是，叶绿体SOD功能的一些线索还不是很明确。通过研究SOD的表达模式以及影响这些酶表达的几个因素，可以寻找这些线索，如SOD的表达调控机理以及各种环境因素产生的影响，包括非生物胁迫和营养物质等。关于SOD功能最直接的证据来自于SOD表达缺失的突变体。拟南芥CCS缺失突变体在叶绿体和胞液没有检测到SOD活性。这表明CCS是SOD表达过程中的关键酶。CCS缺失突变体生长即便在高浓度的Cu离子环境中，仍会缺乏这FSD和CSD活性[40]。然而，CCS缺失并没有产生植物表型的变化，而且在高光胁迫下也没有检测到其对光合作用产生影响。这些结果表明，CSD不是光合抗氧化剂体系中的一个关键组成部分，只是限制了CSD的合成。在这一过程中，植物可能存在其他活性氧清除机制，如APX在叶绿体中起着比SOD更重要的作用[41]。而叶绿体CSD缺失突变体会导致植株生长受抑制，叶绿体变小，同时光合作用能力降低[42]。在一种蓝藻菌中，发现FSD缺失突变体会对光反应氧化胁迫敏感[43]。这说明SOD在叶绿体光合作用中具有不可低估的作用。

4 总结

叶绿体SOD在植物体内除了清除活性氧外，还可以进行电子传递，保护正常光合作用以及信号传递等。SOD在植物体内的功能可能远不止这些。叶绿体作为植物体内SOD种类和含量较多的部位，叶绿体SOD的功能显然与光合作用的部分过程密切相关。研究SOD缺失突变体或SOD基因的超表达并结合植物表现型的分析能够更好地探讨SOD的功能，并且发现更多SOD其他方面的应用。

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