李兰崇 尹志芳 杨宇强 汤梓雄 王玲

几种银杏类制剂中银杏酸的高效液相色谱法测定

李兰崇 尹志芳 杨宇强 汤梓雄 王玲

采用正己烷提取, 薄层色谱纯化, 高效液相色谱法(HPLC)检测并考察几种银杏类制剂总银杏酸的含量。色谱条件为Hypersil ODS C-18(150 mm×4.6 mm.5 µm)；流动相组成为甲醇-3% HAc溶液(92:8, V/V), 紫外检测波长306 nm, 流速1.0 ml/ min, 柱温40℃, 进样量：20 µl, 外标法计算含量。结果表明：总银杏酸线性回归方程为：Y=4998X-100492, r2=0.9986, 线性关系良好。标准品和样品的相对标准偏差RSD均为0.38%, 表明仪器精密度良好。7种银杏产品中, 采摘的新鲜银杏叶中总银杏酸的含量接近于1%, 其余6种市场上的银杏制剂总银杏酸含量均较大程度超过10 ppm。其中, 这一研究结果为正确使用银杏叶产品提供了参考。

银杏类制剂；银杏酸；高效液相色谱法

近年来, 各种银杏类制剂如银杏茶、银杏片、银杏胶囊、银杏注射液因含有较高的总黄酮醇苷、萜类内酯等, 具有降血糖, 软化血管等功效, 逐渐广泛使用于治疗心脑血管类疾病。但同时还含有一类有毒成分银杏酸, 具有致敏性［1,2］、细胞毒性［3,4］和免疫毒性［5］等作用, 其食用安全性已引起人们的高度重视。按照《中国药典2010版》对银杏叶药材的质量标准规定, 有效成分总黄酮不得少于0.4%、银杏总内酯不得少于0.25%。对其毒性成分总银杏酸的含量不得超过百万分之十。从药品安全性角度考虑, 德国Schwabe公司1991年专利中提出银杏酸类化合物含量要求低于10 mg/kg, 德国卫生部1997年提出银杏酸含量应低于5 mg/kg［6］。基于此, 本实验从市面上购买了几种不同的银杏产品, 采用正己烷提取,薄层色谱纯化, HPLC法检测考察其中银杏酸的含量。

1 材料与方法

1.1 材料 银杏叶片a(样品1)、银杏叶片b(样品2)、银杏胶囊a(样品3)、银杏胶囊b(样品4)、银杏茶a(样品5)、银杏茶b(样品6)：市售。银杏叶(样品7)采集于湖南城市学院校园, 树龄4～5年, 于太阳下暴晒至干, 存于密封容器中备用(经测定含水率为11.75%), 银杏酸标准品：上海江莱生物科技有限公司, 并提供了银杏酸的组成和含量(C13：0, 6.2%；C15：1.32.22%；C17：2.1.54%；C15：0.1.14%；C17：1.12.474%), 纯度＞99%。甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、石油醚：色谱纯；超纯水。

1.2 实验仪器 FC-104型电子天平(万分之一)：上海精密仪器有限公司；索氏提取仪：上海洪纪仪器设备有限公司；LC-10AT 型高效液相色谱仪：日本岛津有限公司；U-3010型紫外可见分光光度计：日本岛津有限公司；RE-2000A 型旋转蒸发仪：上海雅荣生化设备仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 银杏酸标准品溶液的制备 准确称取5 mg银杏酸A与10 mg银杏酸B用色谱纯甲醇溶解定容至100 ml, 得浓度为150 µg/ml的银杏酸对照品溶液。分别准确移取6.00、7.00、8.00、9.00、10.00 ml银杏酸对照品溶液用甲醇稀释定容至10 ml得浓度为90、105、120、135、150 µg/ml银杏酸标准溶液。分别吸取20 µL系列浓度的银杏酸标准溶液进样, 测定C13：0、C15：1、C17：2、C15：0、C17：1的峰面积并加和, 以浓度X为横坐标、总峰面积值Y为纵坐标绘制标准曲线, 并进行线性回归, 得回归方程。

1.2.2 样品溶液的制备 由于5种样品中的银杏酸含量差异较大, 故采用了不同的处理方式制备样品溶液。

样品1～6的制备方法［7］：将样品干燥后粉碎, 分别称取20 g粉末(银杏胶囊则取胶囊内粉末), 加入3000 ml经正己烷于85℃下索氏提取10 h, 收集正己烷提取溶液在40℃减压浓缩至干, 用正己烷定容至1 ml。

样品7的制备方法［7］：将银杏叶干燥后粉碎, 称取2 g粉末, 加入300 ml经正己烷于85℃下索氏提取10 h, 收集正己烷提取溶液在40 ℃减压浓缩至干, 用正己烷定容至10 ml。

其余步骤相同［8］：采用微量注射器吸取0.5 ml样品溶液在薄层板上进行条状点样, 展开剂(石油醚：乙酸乙酯：冰醋酸=18：1：1)展开后, 置于三用紫外仪254 nm下, 选取蓝色荧光部分物质进行甲醇洗脱, 定容至5 ml, 微孔滤膜过滤后上机进样分析。再根据样品溶液中银杏酸的浓度确定溶液适度的稀释倍数。

1.2.3 色谱分析条件 根据文献［7］报道, 银杏酸分析的流动相组成为甲醇-3% HAc溶液(92:8, V/V)；色谱柱：Hypersil ODS C-18(150 mm×4.6 mm.5 µm)；紫外检测波长306 nm, 流速1.0 ml/min, 柱温40℃, 进样量：20 µl。色谱数据处理系统为N2000型色谱工作站, 浙江大学智能信息研究所研制。

1.2.4 精密度实验 在上述色谱条件下, 分别取150 µg/ml的银杏酸标准品及样品1提取液注入液相色谱仪, 每次进样20 µl, 连续进样5次, 获得峰面积, 计算相对标准偏差RSD。

1.2.5 加标回收率的测定 加标回收率的测定：采用加标回收法, 准确吸取4 m.150 µg/ml的银杏酸标准品溶液及5 ml浓度为100 µg/ml银杏样品提取液至容量瓶中摇匀, 定容至10 ml, 进样20 µl, 平行实验5次, 测平均回收率。

2 结果

2.1 检测波长的选择 准确移取150 µg/ml的银杏酸对照溶液2 ml于10 ml容量瓶中, 用甲醇稀释至刻度线, 以甲醇溶液作为参比溶液, 用紫外-可见光分光光度计在200～600 nm扫描, 得到其吸收光谱曲线如图1(实践)所示, 吸收波长为306 nm。准确移取样品7提取液1 ml置于10 ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度线, 准确移取1 ml置于10 ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度线, 以甲醇溶液作为参比溶液, 得到其吸收光谱曲线如图1(虚线)所示, 与银杏酸对照品的光谱图基本一致, 因此选择306 nm作为测定波长。

2.2 色谱条件对银杏酸分析效果的影响 按照1.2.2检测条件测得的银杏酸标准品的出峰如图2所示, 说明该条件下5种银杏酸所有的峰都完全分离, 分离度较好。其出峰顺序分别为C13：0、C15：1、C17：2、C15：0、C17：1, 出峰时间分别为10.948、11.882、13.765、17.365、18.665 min, 由于C17：1存在同分异构体, 在图中有小的肩峰。

2.3 银杏酸外标曲线的确定 按照“2.2.3”的方法得到的总银杏酸线性回归方程为：Y=4998X-100492, r2=0.9986。线性关系良好。见图3。

图1 银杏酸对照品及银杏叶(样品7)提取物的吸收光谱图

图2 银杏酸标准品的HPLC图谱

图3 银杏酸标准品的线性拟合曲线

2.4 精密度测定

标准品和样品的相对标准偏差RSD均为0.38%, 表明仪器精密度良好。见表1。

2.5 样品中银杏酸含量及加标回收率的测定, 见表2。

表1 精密度试验

表2 银杏茶样品分析及加标回收试验(n=5)

3 讨论

目前, 国际公认标准为人用治疗剂量中, 总银杏酸的允许最大摄入量为600～1200 µg/d［9］。银杏叶片及银杏胶囊的产品规格一般为0.2～0.5 g/片, 每日用量一般为3～6片/粒,根据表2中的银杏酸含量计算, 因此银杏酸的日摄入量为均＜600 µg, 摄入总量没有超过国家标准, 但产品中银杏酸的含量远远高于国家标准10 ppm。同种类型, 不同厂家的银杏产品银杏酸含量也有较大差异。因此这些市售的银杏叶保健食品, 虽然具有调节人体某些机能的作用, 但适合于某些特定人群食用, 且不适宜于长期食用。而未经加工的银杏叶中银杏酸含量接近1%, 只能作为生产药品的原材料。

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High performance liquid chromatography detection of ginkgolic acids in several kinds of ginkgo preparations

LI Lan-chong, YIN Zhi-fang, YANG Yu-qiang,
et al. School of Chemical and Environmental Engineering, Hunan City University, Yiyan.413000, China

A detection method of ginkgolic acids in ginkgo preparations by high performanceliquid chromatography (HPLC) was established with extraction of n-hexane and purification of thin-layer chromatography. The chromatographic condition was Hypersil ODS C-18 (150 mm×4.6 mm.5 µm). The composition of mobile phase was methanol-3% HAc solution (92:8, V/V). Ultraviolet detection wavelength wa.306 nm, flow velocity wa.1.0 ml/ min, column temperature wa.40℃, and sample amount wa.20 µl. The content was calculated by external standard method. The results showed that the linear regression equation of ginkgolic acids was Y=4998X-100492, r2=0.9986, and the linear relation was good. The relative standard deviations RSD of standard and extraction samples were all 0.38%, which showed the instrument had good precision. In 7 ginkgo samples, the content of ginkgolic acids in fresh ginkgo leaf wa.1%, and that of the other 6 ginkgo drugs were all abov.10 ppm. This study provided references for correct use of ginkgo preparations.

Ginkgo preparations; Ginkgolic acids; High performance liquid chromatography

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.01.175

2014-09-05］

国家级大学生创新创业训练计划项目(项目编号：201211527007)

413000 湖南城市学院化学与环境工程学院