蒲艳

AnnexinⅡ在肝细胞癌中的表达

蒲艳

目的 研究钙磷脂结合蛋白Ⅱ(AnnexinⅡ)在肝细胞癌中的表达意义。方法 以肝细胞癌组织和非肿瘤肝组织进行抑制差减杂交技术(SSH), 构建正、反向差减杂交文库, 差减片断的PCR产物制备cDNA芯片, 筛选出肝细胞癌组织中差异表达基因。使用荧光实时定量技术验证芯片结果, 免疫组化方法分析AnnexinⅡ在肝细胞癌和正常肝组织中的表达。结果 AnnexinⅡ在肝细胞癌中呈现高表达,在肝细胞癌和癌旁肝硬化组织中也呈现高表达, 正常肝脏组织没有表达, 低分化肝细胞癌中具有增高的趋势。结论 在肝细胞癌的检查和诊断期间, AnnexinⅡ可以作为检测标准之一, 观察患者肝细胞恶化或转移、侵袭的情况。

肝细胞癌；钙磷脂结合蛋白Ⅱ；免疫组化

本次研究主要针对肝细胞癌中的AnnexinⅡ表达情况,观察不同患者之间的表达差异性, 分析AnnexinⅡ在肝细胞癌中的表达。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本次研究选取本院病理诊断为肝细胞癌患者, 并进行肝移植手术1例, 同时选取肝癌组织和非肿瘤肝组织数块, 将其放入液氮中在-70℃下进行保存, 选择本院肝癌石蜡组织标本79例, 其中男56例, 女23例, 年龄43～74岁, 平均年龄54岁。患者的肝癌症状按照WHO划分标准进行划分, 其中Ⅰ级21例,Ⅱ级37例,Ⅲ级21例。选取(本院鉴定中心提供)正常肝石蜡组织8例, 其中男5例,女3例, 年龄43～77岁, 平均年龄54岁。

1.2 材料 研究使用的材料主要包括：美国Clontech公司提供的PCR-SelectTMcDNA Substraction Kit；美国Qiagene公司提供的mRNA磁珠法纯化试剂盒、Sigma公司出产的Trizol；Promega公司生产的Rnaseinhibitor和M-MLV RT；A&B公司出产的SYBR Green PCR Master Mixture;武汉博士的公司出产的AnnexinⅡ多克隆抗体；福州迈新生物技术开发公司出产的Elicision Plus, 分析纯试剂选用进口分装。

1.3 方法

1.3.1 构建抑制差减杂交文库 将100 mg的肝癌组织和非肿瘤肝组织分别放入1 ml Trizol当中匀浆, 氯仿和异丙醇抽提, 之后对所抽提RNA的A260及A280进行测定, 计算A260除A280确定RNA的纯度及质量, 使用磁珠法纯化试剂盒纯化分离mRNA, 操作按照说明书的使用标准进行, 构建差减杂交文库, 将第二轮PCR扩增产物克隆进入pMD-18T载体, 转化JM109感受态细菌, 并使用蓝白斑法筛选阳性克隆［1］。

1.3.2 进行cDNA芯片的制作 扩增阳性克隆中的插入片段, 纯化PCR产物后进行cDNA芯片制备, 为cDNA测序及同源性的分析, 将cDNA芯片结果显示在肝癌组织中的差异表达克隆进行测序, 并使用Blast进行比对, 进一步分析在发生或肝癌发展当中具有影响较大的基因。

1.3.3 分别提取、逆转录肝癌组织和肺肿瘤肝组织RNA 选取cDN.40 ng, 上下游引物各20 mol/L及2×SYBR Green PCR Master Mixtur.10 μl, 在蒸馏水不足反应体系20 μl, 在实时荧光定量PCR仪ABI Prism 7000上进行。计算样本中AnnexinⅡ的mRNA拷贝数相对量。免疫组化按照Elivision plus试剂盒的操作要求进行, PBS代替一抗体作为阴性对照参考, 使用Leica RX型图像分析系统采集图像分析免疫组化的结果, Qwin软件识别阳性表达面积和积分灰度值, 每一张切片采集5个视野, 视野为×200, 其中阳性的表达面积比在5%以上,反之为阴性。

1.4 统计学方法 本次研究使用SPSS18.00统计学软件进行分析。计数资料采用秩和检验；计量资料以均数±标准差( x-±s)表示, 采用单因素分析, 两两比较采用SNK法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA的完整性 本次检验的RNA和mRNA的A260/A280＞1.8,研究成功构建差减文库, 插入的片段通过PCR的鉴定, 结果在96%以上的克隆都具有扩增产物, 产物在200～700 bp之间, 通过对肝细胞癌中的高表达克隆测序, 并对其进行Blastn比对, 发现一个与AnnexinⅡ同源性为100%的基因, 检验分析认定为AnnexinⅡ基因。通过荧光定量检测, 肝癌组织中的AnnexinⅡ的mRNA拷贝数是非肿瘤肝组织的4.05倍。

2.2 免疫组织化学 通过肝细胞癌组织和癌旁肝硬化组织与正常肝组织进行比较, 结果AnnexinⅡ的阳性表达差异具有统计学意义(P＜0.05), 其中肝细胞癌、癌旁肝硬化与正常肝组织比较差异具有统计学意义(P＜0.05), 而癌旁肝硬化组织与正常肝组织差异无统计学意义(P＞0.05), 见表1。

2.3 在肝细胞癌组织和正常肝组织当中的AnnexinⅡ表达阳性率比较当中, 肝细胞癌与正常组织差异具有统计学意义(P＜0.05)；而高中分化、中低分化、高低分化比较差异无统计学意义(P＞0.05), 见表2。

表1 肝细胞癌组织、癌旁肝硬化组织与正常肝组织当中的AnnexinⅡ表达阳性面积百分比及积分灰度值比较(s)

表1 肝细胞癌组织、癌旁肝硬化组织与正常肝组织当中的AnnexinⅡ表达阳性面积百分比及积分灰度值比较(s)

注：在组别比较之间, 肝细胞癌与正常肝组织相比,aP＜0.05；癌旁肝硬化与正常肝组织相比,bP＜0.05；癌旁肝硬化组织与正常肝组织相比,cP＞0.05

组别阳性面积百分比(%)积分灰度值(×106)肝细胞癌组织高分.10.589±14.108a.10.892±14.002a中分化 6.671±8.939a7.512±9.512a低分化 7.881±8.091a8.398±8.201a癌旁肝硬化组织.23.033±11.087bc.23.579±10.498bc正常肝组织0.054±0.0850.048±0.072

表2 肝细胞癌组织和正常肝组织中的AnnexinⅡ表达阳性率(n, %)

3 讨论

本次研究通过实验室研究分析, 采用芯片筛选的方法,观察肝细胞癌的差异表达基因, 研究的可信度较高, 研究中的AnnexinⅡ已经不仅仅只是参与炎症反应机制方面的内容,同时AnnexinⅡ还是核心区保守, N端存在的结合结构域, 可以通过癌基因pp60v-src、血小板源性生长因子受体和胰岛素受体在酪氨酸23进行磷酸化修饰, 蛋白激酶C在丝氨酸25进行磷酸化修饰, 进行信号转导、分化等均发挥着重要的功能。通过研究发现, AnnexinⅡ和细胞分类调控及肿瘤生长的关系非常紧密, 如果AnnexinⅡ的表达失调, 那么癌细胞的表达也往往上调［2］。本次同源性研究中发现AnnexinⅡ的mRNA拷贝数是正常肝组织的4.05倍, 而其他也均表现为高表达的结果, 免疫组化分析当中, 所有高中低分化肝细胞癌组织的阳性表达率均较高, 与正常肝组织的差异性较大,差异具有统计学意义(P＜0.05), 证实AnnexinⅡ在肝细胞癌当中具有较强的差异表达性, 也已在一定程度判定肝细胞癌患者的发生及发展。

［1］ Stewart BW, Kleihues P. World Cancer Report. Ly-on: IARC.2003:1-351.

［2］ 陈建国, 宋新明.中国肝癌发病水平的估算与分析.中国肿瘤.2005.14(1):28-31.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.01.023

2014-08-05］

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