陈志恒，马晋芳，肖 雪,3，梁 洁，李莎莎

(1.潍坊市食品药品检验检测中心，山东 潍坊 261205；2.中山大学 南沙研究院，广东 广州 511458； 3.广东药学院，广东 广州 510006；4.广东省中医院，广东 广州 510006)



参芪王浆养血口服液单糖成分高效液相指纹图谱研究

陈志恒1，马晋芳2，肖 雪2,3，梁 洁3*，李莎莎4*

(1.潍坊市食品药品检验检测中心，山东 潍坊 261205；2.中山大学 南沙研究院，广东 广州 511458； 3.广东药学院，广东 广州 510006；4.广东省中医院，广东 广州 510006)

目的：将参芪王浆养血口服液经3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮(PMP)试剂衍生化后，采用高效液相色谱法建立其单糖类成分的指纹图谱，为该制剂的质量控制提供依据。方法：采用Phenomenex Luna RP C18(250mm×4.6mm，5 μm)色谱柱，流动相为0.1mol/L磷酸二氢钾缓冲盐(pH=6.7)(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，流速为1.0mL/min，检测波长为250nm。结果：建立了参芪王浆养血口服液中单糖类成分的HPLC指纹图谱，以10个共有峰作为参照峰，采用指纹图谱评价软件计算相似度均≥0.85。结论：采用高效液相色谱法建立参芪王浆养血口服液单糖类成分的指纹图谱可为该制剂的内在质量控制提供参考依据。

参芪王浆养血口服液；单糖；高效液相色谱法；指纹图谱

参芪王浆养血口服液(Nourishing Oral Liuid of Royal Jelly, Ginseng and Astragalus Root)由人参、黄芪、当归、蜂王浆等原料经现代生产工艺加工而成，主要功效为补益气血、养心安神，可用于气血两虚证的治疗，症见神倦乏力、食欲不振、失眠等[1]。目前参芪王浆养血口服液执行质量标准较低，不能有效控制产品质量。与传统的检测手段相比，指纹图谱是国际公认的控制中药质量最有效的方法之一，其可较为全面地反映多种成分在中药中的含量分布情况[2-4]。在前期的研究基础上[5-6]，本试验进一步对衍生化后的参芪王浆养血口服液进行高效液相色谱(HPLC)分析，建立了该制剂中单糖类成分的HPLC指纹图谱，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UltiMate 3000高效液相色谱仪，包括梯度泵SR-3000，自动进样器WPS-3000，柱恒温系统TCC-3000，紫外检测器DAD-3000，色谱工作站变色龙7.2(美国Thermo公司)；XS-205 DualRange型十万分之一分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 试药

乙腈(色谱纯，Fisher公司)，甲醇、磷酸二氢钾缓冲盐、3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮(PMP)、盐酸、氢氧化钠、氢氧化钾均为分析纯(广州化工厂)，纯化水自制。

参芪王浆养血口服液由吉林敖东延边药业股份有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 PMP甲醇溶液配制

称取21.775g PMP于250mL容量瓶中，采用甲醇溶解并定容至刻度，以超声助溶。

2.2 色谱条件

色谱柱为Phenomenex Luna RP C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为0.1mol/L磷酸二氢钾缓冲盐(pH=6.7)(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，检测波长为250nm。见表1。

表1 流动相洗脱程序

2.3 样品供试品制备

精密量取参芪王浆养血口服液1mL于100mL容量瓶中，用纯化水定容至刻度，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.4 样品衍生化

精密吸取参芪王浆养血口服液稀释品溶液200μL 2份于具塞离心管中，分别编号为样品1、样品2，加入0.3mol/L NaOH 200μL，充分混匀，后加0.5mol/L PMP甲醇溶液160μL，混匀后置于70℃水浴加热30min，取出放冷，再加0.3mol/L HCl 200μL中和碱液，加纯化水1 240μL、氯仿2mL，摇匀，3 500转/min离心5min，弃去氯仿层。重复萃取3次，水层过0.45μm滤膜，收集滤液注入HPLC。分别取5μL各供试品溶液衍生化后，注入HPLC仪进行测定。见图1。

图1 参芪王浆养血口服液中单糖衍生化后的色谱

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 取批号为“1202001”的参芪王浆养血口服液成品，按照“2.3”项下方法制备样品溶液，按照“2.2”项下色谱条件连续进样6次，记录指纹图谱，以9号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别小于1.0%和3.0%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验 取批号为“1202001”的参芪王浆养血口服液成品6支，按照“2.3”项下方法制备样品溶液，按照“2.2”项下色谱条件分别进样测定，记录指纹图谱，以9号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别小于1.0%和3.0%，表明该方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 取批号为“1202001”的参芪王浆养血口服液成品，按照“2.3”项下方法制备样品溶液，按照“2.2”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、16、24h进样测定，记录指纹图谱。以9号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3.0%，表明样品溶液在24h内性质稳定。

2.6 参芪王浆养血口服液指纹图谱相似度研究[7-9]

分别精密量取多批供试品溶液各5μL，按照“2.2”项下色谱条件进样，记录指纹图谱，通过指纹图谱评价软件(中药色谱指纹图谱相似度评价系统，2004A版)分析，以10个共有峰为参照峰。将实验数据导入指纹图谱相似度评价软件，经自动匹配，生成对照指纹图谱(S)，见图2。各样品与对照色谱图进行比较，采用夹角余弦法计算相似度，进行整体相似度评价。通过相似度分析，发现各批样品的相似度均在0.85以上，样品相似性良好。见表2。

图2 参芪王浆养血口服液参照指纹图谱

批号S1S2S3S4S5S6S7S8S9相似度0．8990．9990．9930．9940．9950．9940．9950．9940．995

3 讨论

按照国家药典委员会关于“中药注射液指纹图谱研究的技术要求(暂行)通知”，采用HPLC梯度洗脱法对参芪王浆养血口服液中的单糖类成分进行了指纹图谱研究。实验结果表明，该方法可操作性强、重复性好，可为参芪王浆养血口服液中单糖成分的研究提供参考依据。

本试验考察了不同温度下单糖指纹图谱的分离度，发现25℃时指标峰分离度变差，35℃和40℃时基线漂移较为严重，而30℃时基线较为平稳，分离度也较好。同时本试验也考察了多个流速的指纹图谱，流速为0.5mL/min和0.8mL/min时，色谱不能完全出峰；流速为1.2mL/min时，各指标峰的保留时间变小，分离度降低；当流速为1.0mL/min时，各色谱峰分离度较高，峰型较好，因此确定1.0mL/min为参芪王浆养血口服液单糖指纹图谱的洗脱流速。

本研究采用衍生化法测定9批参芪王浆养血口服液中单糖成分的相似度，经指纹图谱相似度软件分析，其相似度均在0.85以上。本实验所建立的方法精密度、稳定性和重复性均符合指纹图谱的技术要求，可基于此对参芪王浆养血口服液中的单糖类成分进行HPLC-IT-MS和HPLC-TOF-MS分析，为参芪王浆养血口服液的质量控制提供更多参考依据。

[1] 金光日,洪海.参芪王浆养血口服液中10-羟基-2-癸烯酸(10-HAD)的含量测定[J].长春中医药大学学报,2007,23(5):32-33.

[2] 罗国安,梁琼麟,王义明.中药指纹图谱-质量控制与新药研发[M].北京:化学工业出版社,2009.

[3] 肖雪,罗国安,王义明,等.中药板蓝根高效液相色谱法指纹图谱研究[J].江西中医学院学报,2010,22(3):67-69.

[4] 罗娟敏,肖雪,梁琼麟,等.丹红注射液指纹图谱研究[J].中成药,2011,33(8): 1277-1290.

[5] 祖双,梁洁,刘明颖,等.参芪王浆养血口服液高效液相指纹图谱研究[J].亚太传统医药,2015,11(2):19-21.

[6] 祖双,刘黎锋,梁洁,等.两种相似度表征参芪王浆养血口服液指纹图谱质量研究[J].亚太传统医药,2015,11(3):30-31.

[7] 乔善磊.中药指纹图谱相似度评价研究[D].上海:第二军医大学,2004：5.

[8] 曹进,饶毅,沈群,等.中药指纹图谱及其建立原则[J].中药新药与临床药理,2001,12(3):200-203.

[9] 聂磊,曹进,罗国安,等.中药指纹图谱相似度评价方法的比较[J].中成药,2005,27(3):249-252.

(责任编辑：尹晨茹)

Fingerprints of Monosaccharides in Nourishing Oral Liuid of Royal Jelly, Ginseng and Astragalus Root by HPLC

Chen Zhiheng1,Ma Jinfang2,Xiao Xue2,3,Liang Jie3*,Li Shasha4*

(1.Weifang Center for Food and Drug Control, Weifang 261205,China;2.Nansha Research Institute, Sun Yat-sen University,Guangzhou 511458, China;3.Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China;4.Guangzhou Province Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China)

Objective:To study the HPLC fingerprint and to establish a sensitive and specific method for controlling the quality of Monosaccharides in Nourishing Oral Liuid of Royal Jelly, Ginseng and Astragalus Root (NOLRJGA) derived by PMP reagent.Methods:HPLC method was set up, using Phenomenex Luna RP C18(250mm×4.6mm,5μm)with gradient elution, and the mobile phase was comprised of potassium dihydrogen phosphate-buffered saline(0.1mol/L,pH=6.7) and Acetonitrile, the UV detection wavelength was at 250nm, with a flow rate of 1.0 mL/min.Results:The HPLC fingerprint was set up, and the similarity were higher than 0.85 with a total of 10 peaks as reference peaks by similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM.Conclusion:The quality of Monosaccharides in NOLRJGA can be controlled effectively by HPLC fingerprints.

Nourishing Oral Liuid of Royal Jelly;Ginseng and Astragalus Root; Monosaccharide;HPLC;Fingerprint

2015-04-16

陈志恒(1983-)，女，山东省潍坊市食品药品检验检测中心药师，研究方向为中药制剂分析。

李莎莎(1983-)，女，广东省中医院助理研究员，研究方向为中药质量控制。梁洁(1969-)，女，广东药学院副教授，研究方向为食品安全与中药质量控制。E-mail：liangjie69@126.com

R284.1

A

1673-2197(2015)22-0025-03

10.11954/ytctyy.201522010