缪成鹏，张 晖，杨晓雁，潘 婷，尹玉玲，惠竹梅*

（1.西北农林科技大学 葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.山西戎子酒庄有限公司，山西 乡宁 042100）

氮是酿酒葡萄（Vitis viniferaL.）从土壤中获取的主要营养素，在酿酒葡萄和发酵微生物的生物功能和进程中起着重要的作用[1-2]，在酒精发酵过程中，酵母优先利用的氮源为铵态氮、游离α-氨基酸（脯氨酸除外）和小分子多肽，被称为酵母可同化氮素（yeast assimilable nitrogen，YAN）。铵态氮是酵母可同化氮素的主要成分，是酿酒酵母优先利用的无机氮源；而葡萄汁中的游离氨基酸是葡萄酒发酵香气成分的主要前体物，其含量直接影响葡萄酒中高级醇、酯类及挥发性脂肪酸等香气成分的形成。葡萄汁可同化氮素的组成及含量与品种、生态条件、施肥、土壤管理、果实成熟度等密切相关。葡萄园氮肥的施用和管理，对葡萄和葡萄酒中的成分有潜在的影响[3-5]，另外，葡萄果浆中氮含量和葡萄醪添加可同化氮对酒精发酵动力学和香气物质的组成有重要的影响[6-8]。

国外关于葡萄汁可同化氮的添加对酒精发酵动力学、葡萄酒香气成分及葡萄酒的质量方面进行了很多研究[9-12]，如TORREA D等[12]研究认为，高级醇、支链脂肪酸、支链脂肪酸乙酯含量随葡萄汁中可同化氮含量增加而减少，而中链脂肪酸和中链脂肪酸酯随可同化氮含量增加而增加。目前国内有关可同化氮与酵母生长、发酵动力和发酵香气物质的研究很少，张瑾等[6]研究表明，模拟葡萄汁中可同化氮含量增加，酵母菌数量增加，发酵速率加快，高级醇和脂类含量升高。惠竹梅等[13]研究结合前人研究成果，论述了葡萄汁可同化氮对葡萄酒香气物质的影响。

本试验在山西临汾市乡宁县戎子酒庄酿酒葡萄基地进行，对三个葡萄园（驮腰坡、东廒北、东廒南）进行土壤含氮量、赤霞珠葡萄及葡萄酒发酵过程中可同化氮含量、葡萄酒理化指标的检测与分析。通过研究酵母可同化氮含量对酒精发酵动力学及葡萄酒香气成分等的影响，为葡萄园氮肥施用及葡萄酒发酵过程中氮源的添加提供一定的理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

欧亚种酿酒葡萄（Viti viniferaL.）品种赤霞珠（Cabernet Sauvignon）：山西临汾市乡宁县戎子酒庄。

商业果胶酶EX、酵母D254：法国Lallemand公司；氮源NutriSTART：法国Loffort公司。

无水碳酸钠、硫酸铜、氢氧化钠、酒石酸氢钾、磷酸、柠檬酸、碘、浓盐酸，浓硫酸等（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；磷酸氢二钠（分析纯）：洛阳市化学试剂厂；无水葡萄糖（分析纯）：天津市申泰化学试剂有限公司；邻苯二甲酸氢钾（分析纯）：天津市光复科技发展有限公司。

铵离子氮试剂盒Megazyme Ammonia Nitrogen Assay Procedure（96 Assays per kit）、氨基酸氮试剂盒Megazyme Primary Amino Nitrogen Assay Procedure（100 Assays per kit）：爱尔兰Megazyme International Ireland有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2FD型洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；TP-2101型十分之一天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；DHG-9146A型干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；UV-1800紫外分光光度计、AUW-220D型十万分之一天平：日本岛津公司；TG16-WSC型国产高速离心机：湖南湘仪科学仪器设备有限公司；LDZX-50KBS型灭菌锅：上海申安医疗器械厂；MDF-U73V型超低温冰箱（-80 ℃）：日本Sanyo公司；HP-5970-5890气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；

1.3 方法

1.3.1 试验设计

本研究以山西戎子酒庄有限公司2012年东廒北葡萄园、东廒南葡萄园、驼腰坡葡萄园的赤霞珠为研究对象。葡萄采收当天，采集试验葡萄园土壤，检测土壤全氮、硝态氮和铵离子氮；同时检测葡萄果实中YAN含量。

葡萄采收后在相同的条件下进行酿酒实验，另外，三个葡萄园中葡萄可同化氮含量最低的为东廒南，因此选作添加助剂NutriSTART对比实验（葡萄破碎24 h后添加，添加量100 mg/kg）。分别测定葡萄破碎后（加果胶酶前）、添加酵母前、发酵中期（比重1.050）、发酵后期（比重1.010）和分离皮渣后酒样的铵离子氮、氨基酸态氮含量，同时在发酵过程中测定温度和比重，监控发酵进程，酒精发酵结束后进行葡萄酒基本理化指标的测定。以上各阶段用100 mL取样瓶取酒样后，在-80 ℃超低温冰箱中储存待检测。

1.3.2 干红葡萄酒发酵工艺流程及操作要点

葡萄→分选→除梗破碎→酒精发酵→皮渣分离→陈酿→成品

操作要点：

（1）葡萄除梗破碎过程中按照果胶酶EX（30 mg/L）、SO2（50 mg/L）添加辅料；

（2）入罐浸渍24 h后添加酵母D254，东廒南在此基础上添加NutriSTART；

（3）控温26～28 ℃进行酒精发酵，每12 h压帽一次，每8 h测温度和比重一次；

（4）当残糖＜4 g/L时，进行皮渣分离，自流汁和压榨汁进行混合；

（5）葡萄酒不进行苹果酸-乳酸菌发酵，添加SO2（50 mg/L）后进行陈酿。

1.3.3 指标测定与方法

（1）土壤取样

葡萄采收当天，同时进行土壤采样。

土样采集方法：同一葡萄园选取5～8个点，用20 cm土钻取0～60 cm的混合土样5～6 kg，风干后按四边形对角取样1 kg，送至西北农林科技大学检测全氮、硝态氮和铵离子氮含量。

（2）果实理化指标测定

在葡萄果实成熟时，2012年10月9日，每试验小区从葡萄行向的两边随机采摘20 kg葡萄，立即带回实验室测定还原糖、总酸、pH值、总酚等理化指标，并按照葡萄酒酿造工艺进行酿酒实验。

（3）葡萄中可同化氮（YAN）含量的计算

采用试剂盒检测氨基酸态氮和铵离子氮含量。计算公式如下：

式中：X1为氨基酸态氮含量，mg/L；V为终体积，mL；MW为氮摩尔质量，g/mol；ε为氮素在波长340 nm处的消光系数；d为光路距离，cm；v为样品体积，mL。

式中：X2为铵离子氮含量，mg/L；V为终体积，mL；MW为氮摩尔质量，g/mol；ε为氮素在波长340 nm处的消光系数；d为光路距离，cm；v为样品体积，mL。

可同化氮含量（mg/L）=X1＋X2

（4）土壤中全氮、硝态氮及铵态氮测定方法

土壤全氮含量的测定采用凯氏定氮法，其计算公式：

式中：V为滴定试样时消耗的盐酸标准溶液体积，mL；V0为滴定空白时消耗的盐酸标准溶液体积，mL；C盐酸标准溶液的物质的量浓度，mol/L；W为土壤样品质量，g；0.014为氮的摩尔质量，kg/mol。

土壤硝态氮（NO3-N）含量的测定采用紫外分光光度法，其计算公式如下：

土壤硝态氮含量（mg/kg）=C×25×D/m。

式中：C为回归方程算出的NO3-N含量；25为测定液总体积，mL；D为稀释倍数；m为鲜土样质量，g。

土壤铵态氮（NH4+-N）含量测定采用氯化钾（KCl）浸提-靛蓝比色法，其计算公式如下：

土壤铵态氮（NH4+-N）含量（mg/kg）=C×V×ts/m

式中：C为显色液铵态氮的质量浓度，μg/kg；V为显色液体积，mL；ts为分取倍数；m为土样的质量，g。

（5）葡萄酒的理化指标测定

酒精度测定GB/15038—2006《葡萄酒、果酒通用试验方法》中的酒精蒸馏法；干浸出物采用密度瓶法；还原糖测定采用直接滴定法；总酸测定采用酸碱滴定法；挥发酸测定采用蒸馏法；二氧化硫测定采用直接碘量法。

（6）静态顶空气质联用法检测葡萄酒中的香气成分[15]

样品处理：取5 mL样品入顶空瓶，加入2 g NaCl，压紧瓶盖，密封。

顶空条件：进样环体积1 mL，样品瓶加压压力138 kPa，加压时间0.2 min，充气时间0.2 min，进样时间1 min。顶空平衡温度50 ℃，顶空平衡时间45 min。

色谱条件：DB-Wax毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度250 ℃；柱温采用程序升温，60 ℃保留5 min，以5 ℃/min升至240 ℃，保留30 min，恒流1 mL/min，分流比50∶1。载气：氦气（He）。

质谱条件：连接杆温度280 ℃，电离方式采用电子电离（electron ionization，EI）源，电离电压927 eV，质谱扫描范围50～500。

定性定量方法：葡萄酒中香气成分利用质谱全离子扫描模式下的总离子流图谱，依据已有标样的色谱保留时间和质谱信息、NIST08标准谱库比对结果以及参考相关文献相结合的方法进行定性分析。各香气成分的相对含量采用气相色谱面积归一化法进行定量。

2 结果与分析

2.1 不同葡萄园中土壤含氮量与葡萄YAN分析

本试验中选择了山西戎子酒庄不同位置的三块葡萄园，分别为驮腰坡、东廒北和东廒南，各葡萄园采集土样后的含氮量分析结果见表1，各葡萄园赤霞珠葡萄果实理化指标检测结果见表2。

根据土壤养分分级标准[16]，本产区试验葡萄园的全氮水平都＜0.05%，属于六级水平，试验葡萄园需考虑氮肥的施用，同时也应该考虑硝态氮与铵态氮的比例。

表1 不同试验葡萄园的土壤含氮量Table 1 Soil nitrogen content in different vineyards

表2 不同葡萄园赤霞珠葡萄果实理化指标Table 2 Physicochemical indexes of Cabernet Sauvignon grapes in different vineyards

由表1和表2可知，土壤全氮、硝态氮含量最高的东廒南葡萄园，赤霞珠可同化氮含量最低，而铵态氮含量最高的驮腰坡赤霞珠可同化氮含量最高，铵态氮相近的东廒北和东廒南葡萄园赤霞珠可同化氮含量相近，这说明葡萄果实可同化氮含量可能主要与土壤铵态氮含量有关。

2.2 葡萄酒酿造过程中可同化氮、温度与比重的变化

葡萄酒酿造过程中可同化含量变化见图1，温度与比重变化见图2。

图1 葡萄酒发酵过程中可同化氮含量的变化Fig.1 Change of assimilable nitrogen content during wine fermentation

由图1可知，不同葡萄园的赤霞珠葡萄汁可同化氮的含量不同，均超过了150 mg/L，这些都远高于采收前葡萄中可同化氮的含量，说明葡萄果皮中的可同化氮浸渍到葡萄汁中，可同化氮含量保证了发酵顺利进行。如果需要添加可同化氮时，应以此时测定的可同化氮含量为依据，避免添加过量。发酵中酵母对可同化氮的利用主要集中在发酵旺盛之前阶段，当比重降至约1.050以后，葡萄酒中检测不到可同化氮。说明对于YAN含量较低的葡萄汁，如果需要给酵母补充氮源，在此阶段之前比较适宜。

图2 葡萄酒发酵过程中温度比重的变化Fig.2 Change of temperature and density during wine fermentation

由图2可知，不同葡萄园的赤霞珠含糖量基本一致，并提供相同的发酵条件。三个不同葡萄园的赤霞珠葡萄酒发酵温度变化趋势基本一致，发酵过程中酒体比重的变化趋势也基本一致。因此，图1中可同化氮含量保证了图2中发酵顺利的完成。东廒南助剂赤霞珠比重下降速率高于东廒南，说明东廒南赤霞珠添加氮源后，发酵速率增加。

2.3 葡萄酒理化指标分析

酒样结束酒精发酵后，经过皮渣分离，自流汁和压榨汁混合后装入1.5 L的酒瓶中进行陈酿，按游离二氧化硫30 mg/L进行添加。陈酿期间取样检测理化指标，结果见表3。

表3 不同葡萄园赤霞珠葡萄酒基本理化指标Table 3 Physicochemical indexes of red wine produced by Cabernet Sauvignon grapes in different vineyards

由表3可知，葡萄酒发酵正常，基本指标均达国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》要求，葡萄酒理化指标没有明显差异。在添加助剂的实验中，东廒南助剂表现出较低的酒精度，但葡萄酒的干浸出物含量增加。

2.4 葡萄酒香气成分分析

采用GC-MS法对各葡萄园的葡萄酒进行香气成分分析，结果见图3，香气成分相对含量见表4。

图3 驮腰坡(A)、东廒北(B)、东廒南(C)及东廒南助剂(D)葡萄酒香气成分总离子流色谱图Fig.3 Total ion chromatogram of aromatic components of Tuoyaopo (A),Dongaobei (B),Dongaonan (C) and Dongaonan NutriSTART (D) wines

由图3及表4可知，葡萄酒中的酯类主要为丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸己酯、葵酸乙酯等。其中，丁酸乙酯能带来酸果香、草莓香，己酸乙酯带来青苹果、草莓香和茴香，辛酸乙酯赋予酒果香和茴香味；各葡萄酒中的醇类主要有正-丙醇、2-甲基丙醇、3-甲基-1-丁醇、正己醇和苯乙醇等。其中，正-丙醇能使酒更清爽，2-甲基丙醇具有苦杏仁味的特点，3-甲基-1-丁醇带给酒奶酪味，而正己醇和苯乙醇分别赋予酒吐司味和花香[13-14]。

表4 葡萄酒中香气成分相对含量Table 4 Relative contents of aromatic components in wine

酯类和醇类相对含量表明，驮腰坡＞东廒南助剂＞东廒北＞东廒南，这与葡萄汁中可同化氮含量呈正相关。张瑾等[6]研究表明，模拟葡萄汁中可同化氮含量增加，酵母菌数量增加，发酵速率加快，高级醇和脂类含量升高。本试验结论与其研究结果一致。

3 结论

本试验中葡萄园的全氮水平都＜0.05%，属于六级水平。土壤全氮、硝态氮含量最高的东廒南葡萄园，赤霞珠可同化氮含量最低，而铵态氮含量最高的驮腰坡赤霞珠可同化氮含量最高，铵态氮相近的东廒北和东廒南葡萄园赤霞珠可同化氮含量相近，这说明葡萄果实可同化氮含量可能主要与土壤铵态氮含量有关。葡萄酒中酯类和醇类相对含量由高到低依次为：驮腰坡＞东廒南助剂＞东廒北＞东廒南，这与葡萄汁中可同化氮含量呈正相关。因此，土壤中的铵态氮含量，通过对可同化氮含量直接影响，间接影响了葡萄酒中香气物质的含量，这将对葡萄园施氮等管理对葡萄酒香气物质的影响起到一定的指导作用。

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