郑祖亮，方连英，赵 辉，杜 刚*

（天津商业大学 生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134）

葡萄酒发酵是一个复杂的生理生化过程，涉及不同种属的酵母菌和细菌。葡萄汁中含有许多不同种属的酵母，其中仅酿酒属（Saccharomyces）酵母负责乙醇发酵，并且它的次级代谢产物（如酯类、醛类、酮类、醇类和萜烯类等）是葡萄酒香气的主要来源，其发酵性能严重影响葡萄酒的质量[1]。研究表明，低温（10～15 ℃）发酵影响酿酒酵母代谢产物组成，促进葡萄酒芳香化合物的合成，被广泛应用于葡萄酒酿造业[2]。然而，低温发酵也存在一些危害，如漫长的发酵周期、迟缓的发酵速率，甚至是中止发酵。对酿酒酵母进行低温筛选、改造，以提高其低温耐受性是解决这一工业难题的关键。因此，国内外学者一直把酿酒酵母响应低温胁迫的耐受机制作为研究的重点，以便为选育优良酿酒酵母提供理论指导。本文主要介绍了不同酿酒酵母在低温条件下基因差异性表达、生理特性变化以及低温识别和响应机制的研究进展，旨在为更好的研究酿酒酵母低温耐受机制提供一定的参考。

1 低温胁迫对酿酒酵母的影响

在葡萄酒发酵过程中，低温（10～15 ℃）不仅会减缓酿酒酵母的新陈代谢，延长发酵周期，还会影响乙醇、甘油和其他次级代谢产物的合成[3]。GAMERO A等[1-2]分析比较13种商业酿酒酵母分别在28 ℃和12 ℃发酵周期和代谢产物的变化，结果发现，在12 ℃时它们的发酵周期均在14～25 d，与28 ℃相比延长了2～3倍；然而在这两个温度条件下，糖的消耗量基本相同，主要代谢物（乙醇和甘油）的合成量没有显著性差异（P＜0.05），但是芳香化合物的合成量却存在巨大差异，乙酯类更易在12 ℃合成，高级醇和醋酸酯类却恰好相反。另外，低温还影响酵母细胞RNA二级结构的稳定性，降低细胞膜的流动性、蛋白质的翻译率和折叠速率，导致错误折叠蛋白的积累、酶的失活、营养物质转运速率和细胞繁殖速率的降低，甚至使细胞处于休眠状态[4]。尽管低温对葡萄酒发酵造成一定的危害，但是又促进了葡萄酒中乙酯、萜烯类物质的合成，降低高级醇和醋酸酯类的含量，增加葡萄酒的香气。

2 酿酒酵母对低温胁迫的应激反应

从基因组和转录组学等方面分析比较不同种属（嗜温和嗜冷）酿酒酵母响应低温胁迫的差异性变化，发现基因的转录表达、翻译效率和脂质的组成存在显著性差异。这些变化与低温耐受性密切相关。

2.1 脂质组成与低温耐受性

生物膜是细胞内部环境与外部环境的第一层屏障。当酵母细胞处于低温环境时，细胞膜的物理特性首先受到影响，如降低细胞膜流动性。研究表明，增加细胞膜中不饱和脂肪酸和中链脂肪酸脂质的含量，可提高细胞膜的流动性，并且这些脂质含量的高低与酵母适应低温生长密切相关[2-5]。分析酿酒酵母在低温下脂质组成变化，结果发现在12 ℃条件下中链脂肪酸、三酰甘油、固醇酯和鲨烯的含量普遍升高，而长链脂肪酸、磷脂酸的含量和卵磷脂/磷脂酰乙醇胺的比例均降低[6]。另外，利用基因工程技术，将与脂质合成相关基因做敲除或高表达处理，结果发现，涉及磷脂（PSD1和OPI3）、甾醇（ERG3和IDI1）和鞘磷脂（LCB3）途径的基因，其缺失严重损害低温环境下酵母细胞的生长繁殖，而它们的高表达菌株却几乎使生长周期缩减了一半，提高了发酵速率[7-8]。

2.2 基因的转录表达和翻译效率与低温耐受性

TRONCHONI J等[9]利用基因芯片技术分别研究嗜温酿酒酵母（S.cerevisiae）和嗜冷酿酒酵母（S.kudriavzevii）（两者之间86%的基因序列相似）在28 ℃和12 ℃全基因组转录表达差异性，结果发现，S.cerevisiae的177个基因被上调和194个基因被下调，而S.kudriavzevii的分别为160个和128个，两者之间无较大差别；然而它们的基因转录水平却存在显著性差异，12 ℃条件下S.kudriavzevii的231个基因被高表达，而S.cerevisiae只有78个；此外，在12 ℃下经过巴龙霉素（蛋白质翻译抑制剂）处理后，S.cerevisiae的生长受到严重抑制，而S.kudriavzevii几乎不受影响，在28 ℃下的恰好相反。这表明S.kudriavzevii的耐受低温特性是由于低温环境下基因的转录表达量和蛋白质的翻译效率被提高。

3 酿酒酵母对低温胁迫的响应机制

图1 酿酒酵母低温信号通路示意图[10]Fig.1 Schematic diagrams of the low temperature signal pathways in S.cerevisiae

信号转导途径与环境刺激所引起的细胞应答反应密切相关。在真核细胞中最常见的信号转导途径是促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase cascades，MAPKs）级联，通过连续的磷酸化传递信号，激活相应的细胞应答。在酿酒酵母中有五个核心MAPKs：Hog1p、Slt2p、Fus3p、Kss1p和Smk1p，分别调控高渗透性甘油合成（the high osmolarity glycerol pathway，HOG）、细胞壁完整性（the cell wall integrity pathway，CWI）、细胞繁殖、菌丝生长和产孢途径[10]。研究表明，低温耐受性与HOG、CWI、环磷酸腺苷活化蛋白激酶A（the cAMP-activated protein kinase A pathway，cAMP-PKA）和雷帕霉素信号级联（the target-ofrapamycin signaling pathway，TOR）途径密切相关（见图1）。

3.1 HOG途径对低温信号的识别与转导

HOG途径是酿酒酵母维持细胞内外渗透压平衡以适应外界高渗环境的信号转导途径，由两个上游渗透压感应受器（Sln1-Ypd1-Ssk1和Sho1分支）和下游MAPK级联系统组成（如图1）。胁迫信号由Sln1-Ypd1-Ssk1和/或Sho1分支传递到Pbs2p MAPKK，激活Hog1p MAPK。活化的Hog1p MAPK进入细胞核调控一系列的转录因子，如Sko1p、Smp1p、Hot1p、Msn2p/Msn4p等，进而调控一系列相关基因的转录表达，以适应外界环境的变化[11]。

HOG途径中，基因Sho1突变体对低温胁迫不敏感，而基因Ssk1突变体对低温胁迫敏感，此外基因Hog1突变体会损害海藻糖合成酶基因、甘油合成酶基因和小分子伴侣的表达，进而影响酵母细胞的正常生长[12]。基因Ole1、Tip1和Nsr1由活化的Hog1p MAPK独立诱导，它们的转录表达促进了胞内甘油的合成和积累，以保护细胞免受低温损伤[13]。由此可知，HOG途径是酿酒酵母响应低温胁迫的一种应激方式，且低温信号由Sln1-Ypd1-Ssk1分支所识别。

3.2 酿酒酵母CWI途径对低温信号的识别与转导

CWI途径具有调控基因表达、蛋白质合成、细胞骨架维护、DNA修复和细胞代谢等功能[14]。典型的CWI途径由细胞壁完整性和应激反应元件家族（wall integrity and stress response component，Wsc）、Pkc1p MAPKKKK、Bck1p MAPKKK、Mkk1p/Mkk2p MAPKK和Slt2p MAPK组成（如图1）。CWI途径不仅修复由化合物、氧化和热休克所造成的细胞壁损伤[15]，而且响应低温胁迫。

CWI途径中，Wsc1p是最重要的低温信号识别元件。12 ℃条件下，Wsc1突变体降低Slt2p的磷酸化水平，影响酵母细胞的正常生长，而在Wsc2/Wsc3双突变体中此缺陷更加明显。另外，缺少Rom1p或Rom2p（Pkc的两个上游效应器）、Bck1p、Mkk1p/Mkk2p或Slt2p都严重影响低温条件下酵母细胞的生长繁殖[16-17]。由此可知，CWI途径对响应低温胁迫有着重要作用。然而，让人不解的是Slt2p的磷酸化完全依赖于Bck1p，而Bck1突变体经热处理后仍然能够激活Slt2p[18]。低温信号是如何从Wsc1p-3p传递到MAPK模块，此过程是否只依赖Bck1p和Pkc1p传递信号，这些理论机制目前尚不清楚。

3.3 各转导途径相互协调以响应低温胁迫

在长期的进化过程中，真核生物形成了一系列非常保守的生理适应机制。这些机制不仅独立响应环境胁迫，而且大多数情况下是以相互协调的方式对外界环境变化做出应答。

CWI途径中，Slt2p的激活可能需要额外胁迫信号的输入，并且需要其他效应器或MAPK信号途径的介导[15]。有趣的是，Hog1p MAPK的磷酸化峰在低温处理5 min左右出现，而Slt2p MAPK的活化峰出现在120～180 min之间，这说明CWI途径不能直接感知低温信号，而是通过其他MAPK途径引发的二次效应[19]。另外，HOG途径中的Sho1分支对于CWI途径响应酶解酶胁迫是必不可少的[20]，也有证据表明HOG和CWI途径并不相互排斥[21]，它们之间相互协调，共同响应低温胁迫。遗憾的是，目前并没有直接证据表明CWI途径是由Hog1p信号激活的。

TOR和cAMP-PKA途径是酵母细胞调控营养生长的主要元件[22-23]。这两个途径中各元件基因的突变体在低温下都显示生长缺陷。如Torc1（编码TOR激酶复合物I）或Ira2（cAMP-PKA途径的负调控因子）突变体对低温敏感，而Ras2突变体会促进低温条件下细胞的生长[17，24]。CWI途径中Slt2p 的激活导致Torc1p 失活，间接抑制Sch9p（TORC1信号转导的下游靶点）的活化[22]，并直接激活Bcy1p，随之降低PKA的活性[25]。CWI-TOR-cAMP-PKA途径之间似乎有着密切的关联，并且Slt2p对协调各途径以适应低温环境发挥着重要作用。

4 展望

Saccharomyces是葡萄酒酿造的主要微生物，提高其低温耐受性不仅保证低温发酵过程中具有良好的繁殖能力和发酵活性，还可促进芳香化合物的合成，提高葡萄酒的品质和产量。目前，对不同种属酿酒酵母低温耐受性做了大量研究，发现了许多与低温适应性相关的新途径，例如氧化还原酶和维生素合成途径，以及氨基酸代谢等[26-27]；以及利用基因工程对商业酿酒酵母（QA23，Lallemand Inc）进行改造，基因Csf1、Hsp104和Tir2等的过表达菌株不仅缩短了低温生长周期，还提高了发酵速率。尽管如此，酿酒酵母耐受低温的理论机制仍不清楚，基因工程改良菌株也仅停留在实验室阶段。随着基因组学、转录组学等技术的发展，相信越来越多的未知功能基因将会被发现，酿酒酵母低温耐受性的理论机制也将更加清晰。这将指导获取低温耐受性的新型酿酒酵母以及形成新的策略提高葡萄酒发酵产量和质量，以此解决葡萄酒低温发酵所面临的种种困难。

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