郭　龙　汤细彪　刘　田　董　超　刘　峰　喻红艳　吴　斌

华中农业大学动物疫病诊断中心，武汉430070



2014年猪群常见细菌性疫病的分离鉴定与流行病学调查

郭龙汤细彪刘田董超刘峰喻红艳吴斌

华中农业大学动物疫病诊断中心，武汉430070

摘要2014年华中农业大学动物疫病诊断中心对湖北、湖南、河南、广东、浙江等21个省市送检的12 452份临床病料进行细菌分离、生化试验和PCR方法鉴定，共分离出3 926株致病菌，并对其中所分离到的225株副猪嗜血杆菌和231株链球菌采用玻片凝集方法进行血清型分型。结果表明链球菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、波氏杆菌、致病性大肠杆菌和猪丹毒丝菌等9种病原菌已严重影响我国规模化养猪业的健康生产。

关键词猪；细菌；血清型；分离鉴定；流行病学

郭龙，男，硕士，华中农业大学动物疫病诊断中心细菌室主任。

1　材料与方法

1.1病料及来源

病料采集于湖北、湖南、河南、广东、浙江、安徽、江西、河北、福建、山东、上海等21个省市的发病猪场，分离组织主要包括出现病理变化的肺、气管、脑、关节、脾脏以及淋巴结等。

1.2主要材料及仪器

胰蛋白大豆肉汤（TSB）和胰蛋白大豆琼脂（TSA）购自美国Becton Dickinsonand Company公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD，又称V因子）购自中国医药（集团）上海化学试剂公司；犊牛血清购自杭州四季青公司；麦康凯培养基、三糖铁培养基和生化鉴定管购自杭州天和微生物试剂公司，CO2培养箱购自Thermo Forma公司；生物显微镜购自Nikon公司，链球菌和副猪嗜血杆菌分型所用标准血清为本实验室制备和保存。

1.3细菌初步分离

在超净工作台中，对各脏器表面进行消毒，严格无菌操作取各脏器深层一小块组织，将所取组织均匀涂抹于含犊牛血清和NAD的TSA培养基一角，分区划线，置于5% CO2培养箱，37℃培养24～48 h。

1.4细菌的纯化鉴定

在培养好的原代TSA平皿中用无菌的接种环挑取菌落少许，作抹片、革兰氏染色、镜检。若其染色和细菌形态与怀疑的致病菌一致，可挑取1个单菌落进行传代培养，所得培养物为纯培养菌株。纯培养物的目的在于对分离的病原菌进一步进行生化鉴定和其他试验。

1）链球菌的鉴定。

形态特征：为革兰氏阳性菌，在脏器图片标本中呈单个或成对卵圆形，菌落小，灰白，透明，液体培养染色呈短链状排列。

培养特性：普通琼脂培养平板上37℃培养24 h后长成灰白色透明的小菌落，多呈β型溶血。

2）副猪嗜血杆菌的鉴定。

形态特性：革兰氏阴性杆状菌，具有多形性，从球杆状到纤细状。

培养特性：本菌在巧克力琼脂上培养48～72 h依然生长很差，菌落为光滑型，灰白色透明，不溶血，本菌生长严格需要V因子，不需要X因子。如果与金黄色葡萄球菌同时划线37℃培养24～48 h后，有典型的“卫星生长现象”，并且副猪嗜血杆菌菌落周围不溶血。

生化特性：氧化酶试验阴性，接触酶试验阳性，尿素酶试验阴性，不长生靛基质，不溶血，CAMP试验阴性，发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、麦芽糖等碳水化合物。

3）巴氏杆菌的鉴定。

形态特性：革兰氏染色呈红色的细小球杆菌，瑞氏染色呈两极浓染。

培养特性：血液琼脂平板上生长良好，24 h长成淡灰色、露珠样小菌落，表面光滑闪亮，边缘整齐，不溶血。在麦康凯培养基上不生长。

生化特性：不形成靛基质，不液化明胶，产生硫化氢和氨，MR、VP阴性。

4）波氏杆菌的鉴定。

形态特性：革兰氏阴性、两极着色、散在或成对排列、呈细小球杆状菌。

培养特性：血液琼脂平板上生长良好，48 h长成淡灰色、露珠样小菌落，表面光滑闪亮，边缘整齐，不溶血。在麦康凯培养基上不生长。乳黄色、表面光滑、边缘整齐、中心隆起、黏稠、扁平。

生化特性：尿素酶试验阳性、能利用柠檬酸盐、还原硝酸盐、不产生靛基质、不产生硫化氢、MR和VP试验均为阴性、不液化明胶，不氧化也不发酵包括葡萄糖在内的所有糖。

5）大肠杆菌的鉴定。

形态特征：革兰氏阴性短杆菌，周身鞭毛，在组织和渗出液图片染色标本中常呈两级着色（比巴氏杆菌大），要注意同巴氏杆菌区别。

培养特性：普通琼脂平皿上37℃培养24 h后，长成圆形、微隆起、湿润、半透明无色菌落。一些致病菌株在绵羊血平板上呈β型溶血。在麦康凯琼脂上长成红色菌落。

6）猪丹毒丝菌的鉴定。

形态特征：革兰氏染色镜检后可见革兰氏阳性两端钝圆或弯曲的细小杆菌，易形成长丝状。

培养特性：分离的细菌在TSA培养基上细菌菌落为圆形、透明、灰白色，针尖大小、光滑、湿润、露珠样的小菌落，培养基中加入血清、葡萄糖、蛋白水解物或表面活性剂吐温- 80，可促进细菌的生长。

1.5分型方法

本实验室利用副猪嗜血杆菌血清1～15型标准菌株成功地制备出15种血清型高免血清（副猪嗜血杆菌15个血清型标准株由澳大利亚昆士兰动物研究中心馈赠），链球菌标准血清采用标准株抗原静脉注射家兔制备。将从临床分离鉴定出的副猪嗜血杆菌和链球菌纯化扩大培养，用无菌生理盐水将菌苔洗下，保证菌量为30亿/mL，取约3 mL副猪嗜血杆菌菌液装入青霉素瓶放入高压蒸气灭菌锅炉121℃，高温处理30 min后放于离心机7 000 r/min离心2 min，所得上清液即为待检抗原，待定型链球菌只需用无菌生理盐水将菌苔洗下，无需高温处理和离心。取载玻片1张，用移液器分别吸取血清及抗原10 μL，用牙签将血清和抗原充分混匀，轻轻摇动玻片1～2 min，在诊断血清中，如混悬液由混浊变澄清并出现肉眼可见的凝集絮状物为阳性结果；如与对照相同，则为阴性结果。

2　结果统计

2.1分离细菌统计

本实验室对2014年全国各地所送检的12 452份临床样品进行细菌分离，各省病原菌的分离情况见表1，从送检病料中共分离到致病菌3 926株，其中链球菌1 469株占所分离细菌总数37.42%，副猪嗜血杆菌883株占22.49%，巴氏杆菌556株占14.16%，波氏杆菌153株占3.9%，沙门菌227株占5.78%，大肠杆菌367株杆菌占9.35%，猪丹毒丝菌94株占2.39%，葡萄球菌155株占3.95%，猪传染性胸膜肺炎23株占0.59%。

2.2部分细菌血清分型统计

1）副猪嗜血杆菌血清分型。

对2014年部分省份所分离到的副猪嗜血杆菌随机选取225株进行了血清型分型。统计结果显示：我国副猪嗜血杆菌主要流行血清型为4型（占32.89%）、5型（25.33%）、13型（13.78%）。

2）链球菌血清分型。

2014年本实验室对部分省份分离到的231株链球菌进行血清型定型，其中1型（7株）占总体比例为3.03%；2型（103株）为44.59%；3型（5株）为2.16%；5型（5株）为2.16%；7型（39株）为16.88%；9型（35）株为15.15%；未定出型（37株）为16.02%。其中，未定出型的37株链球菌有2种可能：一是该链球菌为非猪源链球菌，二是该链球菌的血清型不属于这6种。

3　分析与讨论

2014年华中农业大学动物疫病诊断中心共针对全国规模化养殖场所送检的12 452份样品进行细菌分离，共分离到3 926株致病菌，其中链球菌（1 469株）和副猪嗜血杆菌（883株）占分离总数的59.91%，猪链球菌有35个血清型，副猪嗜血杆菌现已知有15个血清型以上，其血清型间的交叉免疫原性差，并且具有地方流行性，而当前我国副猪嗜血杆菌主要流行血清型为4型、5型，猪链球菌以2型、7型为主。因此有必要经常对本场猪群抗体定期监测和评估，并尽可能选择与本场主要流行血清型相符合厂家的疫苗进行合理免疫，以增强保护力。伴随我国养猪业集约化程度越来越高，细菌性疾病的发生趋势逐渐复杂，以前危害较大的一些疾病如猪丹毒已不再是规模化猪场主要防疫重点，而近2年很多地区养殖场岀现中大猪和种猪群突然高烧（可达41℃甚至以上）喘气、突然发病且病程极短、死亡前口吐血沫、呕吐以及神经症状，部分皮肤上岀现棱形不规则斑块，死亡后发紫败血，解剖主要以肺脏水肿、岀血、气管内有大量泡沫、肾脏高度岀血肿大，且该情况多以散发和以中大猪为主。经本实验室系统病原学鉴定发现：其主要致病菌是猪丹毒，并伴随猪蓝耳病、猪圆环病毒2型、猪链球菌病及猪传染性胸膜肺炎等混合感染问题，其一般发病较急且中大猪损失较惨重。希望规模化猪场能高度重视。

表1　 2014年细菌分离统计株

细菌性疾病目前最好是通过日常必要药物保健和疫苗免疫来进行预防。同时加强对饲料来源污染的生物因子的监测力度，摸清猪场多重感染的原发性感染和继发性感染疾病的种类，建立猪场完善、合理的监测方案，实施种猪场疾病净化，建立健康的种猪群。一旦临床症状已经出现，应合理采用敏感药物进行治疗，发病期间应对整个猪群进行药物预防，而不仅仅只是对那些表现出症状的猪用药，抗生素预防或口服药物治疗对严重的细菌病毒多重感染可能无效，同时治疗费时费力，成本高且易产生耐药性。因此有条件的猪场可以考虑定期通过实验室从典型发病猪中分离具有代表性致病菌进行药敏试验，且选择敏感药物合理使用，从而减少损失。

收稿日期：2015- 08- 30