谭卫国，王文华，周幽心，杜子威

(1 昆山市中医医院神经外科，江苏 昆山 215300； 2 苏州大学附属第一医院)



原发中枢神经系统淋巴瘤组织CXCR5及其配体CXCL13表达和意义

谭卫国1，王文华1，周幽心2，杜子威2

(1 昆山市中医医院神经外科，江苏 昆山 215300； 2 苏州大学附属第一医院)

目的 检测趋化因子受体5 (CXCR5)及其配体CXCL13在原发中枢神经系统淋巴瘤组织表达水平,探讨其在肿瘤发生发展过程中的可能作用。方法 分别采用免疫组化EnVision二步法和半定量RT-PCR方法，检测CXCR5及CXCL13在5例原发中枢神经系统淋巴瘤组织和10例正常脑组织中的表达。结果 免疫组化结果显示，CXCR5和CXCL13在肿瘤标本中阳性表达率均为100%(5/5)，在正常脑组织中阳性表达率均为0(0/10)；半定量RT-PCR检测结果显示，CXCR5和CXCL13在肿瘤标本中全部检出，而在正常脑组织中均未检出。结论CXCR5/CXCL13信号通路在原发中枢神经系统淋巴瘤的发生发展过程中起重要作用。

中枢神经系统肿瘤；淋巴瘤；受体, 趋化因子；CXCL13

原发中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL)是少见的脑内非霍奇金淋巴瘤，主要累及大脑、软脑膜、眼部及脑干，该病占原发颅内肿瘤的3%～4%，大部分为弥漫型大B细胞淋巴瘤[1]。中枢神经系统在正常情况下缺乏B淋巴细胞存在所需要的生理环境，PCNSL为什么会发生在中枢神经系统至今没有明确结论。最近,趋化因子受体及其配体的作用日益受到研究者的关注,趋化因子受体5(CXCR5)及其配体CXCL13对淋巴细胞的趋化作用及对肿瘤细胞增殖等生物学行为影响的相关研究较多。本研究通过检测CXCR5及CXCL13在PCNSL组织的表达水平, 探讨其在肿瘤发生发展过程中可能的作用。

1 材料与方法

1.1标本来源

2010年1月—2012年6月，苏州大学附属第一医院神经外科手术切除并由病理证实的PCNSL标本5例，其中男1例，女4例。5例病人血常规淋巴细胞计数及其占比均位于正常范围，并均行骨髓穿刺检查排除系统性淋巴瘤，HIV抗体检测均阴性。对照组为正常脑组织标本10例，均来自脑外伤行手术治疗的病人。部分标本用甲醛溶液固定24 h，常规石蜡包埋，切片厚度4 μm，待行免疫组化检测；部分标本取下后，立即放入-187 ℃的液氮罐中保存，待行半定量RT-PCR检测。

1.2CXCR5和CXCL13的检测

1.2.1免疫组化检测 采用免疫组化EnVision二步法，按试剂盒说明书操作。CXCR5、CXCL13以细胞膜、细胞质或细胞核内出现棕褐色颗粒为阳性，光镜下随机观察8个高倍视野，计算阳性细胞百分比，阳性细胞百分比>10%为阳性。

1.2.2半定量RT-PCR检测 按照Trizol说明书提取PCNSL及正常脑组织标本总RNA,紫外线分光光度计鉴定,根据260 nm处吸光度值计算RNA浓度。取总RNA 2 μg行逆转录,操作步骤参照试剂盒说明。以逆转录产物为模板,CXCR5、CXCL13和内参照GAPDH引物在同等条件下扩增，产物在凝胶电泳上出现目标条带视为阳性。 CXCR5上游引物序列为5′-GGTCTTCATCTTGCCCTTTG-3′，下游引物序列为5′-ATGCGTTTCTGCTTGGTTC-T-3′；CXCL13上游引物序列为5′-CTCTGCTTCTCATGCTGCTG-3′，下游引物序列为5′-CAGCTTGAGGGTCCACACAC-3′； GAPDH上游引物序列为5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游引物序列为5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。 扩增条件：94 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共40个循环；最后72 ℃延伸5 min。将PCR产物于20 g/L琼脂糖凝胶中电泳并进行拍照。

2 结 果

2.1免疫组化检测

PCNSL组织CXCR5、CXCL13染色呈强阳性，肿瘤细胞的细胞膜、细胞质、细胞核中见明显棕褐色颗粒，而正常脑组织中二者染色均阴性(图1A～D)。CXCR5和CXCL13在PCNSL肿瘤标本中阳性表达率均为100%(5/5)，在正常脑组织中阳性表达率均为0(0/10)。

2.2半定量RT-PCR检测

在全部肿瘤标本中均检出CXCR5和CXCL13 RNA表达，而在正常脑组织中均未检出CXCR5和CXCL13 RNA表达(图2A、B)。

3 讨 论

人类的趋化因子是由50个以上氨基酸组成的小分子分泌蛋白，这些分子主要作用是免疫调节、趋化作用和活化淋巴细胞。它们因邻近N-端的保守半胱氨酸残基的相对位置不同而被分为CXC、CC、C和CX3C等4个亚型。趋化因子受体是由细胞外配体结合区、7个跨膜区和胞内羧基末端组成的G蛋白耦联受体(GPCR)。到目前为止，已发现19种存在于哺乳动物中的趋化因子受体，通常表达于免疫细胞、内皮细胞等细胞膜上。根据其所结合的配体可将趋化因子受体相应分为CXCR、CCR、CR和CX3CR。趋化因子和对应的趋化因子受体结合，可促进细胞增殖和移动[2]。

上世纪90年代, 在研究人伯基特淋巴瘤相关基因时发现了一种特殊的基因, 这也是第一种被发现的在淋巴细胞表面表达的GPCR，被命名为伯基特淋巴瘤受体1(BLR1)。BLR1与白细胞介素8(IL-8) 和其他中性粒细胞趋化因子的受体高度相关，与最近发现的HIV辅助受体CXCR4也有一定

A：PCNSL组织CXCR5染色；B：正常脑组织CXCR5染色；C：PCNSL组织CXCL13染色；D：正常脑组织CXCL13染色。免疫组化EnVision染色，400倍。

图1 PCNSL组织和正常脑组织CXCR5及CXCL13表达

A为CXCR5电泳结果：①为正常脑组织，②～⑥为PCNSL组织；产物条带位于230 bp。B为CXCL13电泳结果：①为正常脑组织，②～⑥为PCNSL组织；产物条带位于200 bp。

图2 CXCR5和CXCL13电泳结果

的相似性。根据趋化因子的命名原则， 将BLR1确定为CXCR5[3]。CXCL13是CXCR5的配体，主要分布在肝脏、血清、淋巴结和胃组织中，此外，在唾液腺和乳房组织中也有少量的分布，CXCL13编码基因位于人染色体4q21。由于它具有吸引B细胞的能力，因此被称为B细胞吸附因子1(BCA-1),或B细胞趋化因子(BLC)。根据趋化因子及其受体的系统命名法，因其受体为CXC族的趋化因子，因此被命名为CXCL13。

在淋巴器官中，大部分B细胞分布于淋巴组织滤泡中，其主要原因为淋巴滤泡中基质细胞上表达的CXCL13能趋化表达有CXCR5的B细胞移动、定位[4]。CXCR5及CXCL13在多种淋巴增生疾病中表达，与肿瘤形成及进展有关。HUSSAIN等[5]研究显示，CXCR5与CXCL13信号通路在艾滋病相关非霍奇金淋巴瘤(AIDS-NHL)的发生以及生长过程中起作用。

本研究采用免疫组化方法和半定量RT-PCR进行检测，结果显示，CXCR5与CXCL13在肿瘤组织中均高表达，而在正常脑组织中则均无表达。说明CXCR5/CXCL13信号通路在PCNSL的病理过程中起重要作用。SMITH等[6]的研究表明，PCNSL中的恶性B淋巴细胞及血管内皮细胞表达B细胞趋化因子CXCL13。也有研究结果表明，CXCR5与其配体CXCL13相结合，激活了Akt和ERK1/2通路[7]，而该通路与淋巴细胞活化及肿瘤细胞增殖、凋亡密切相关。由此我们认为，CXCR5/CXCL13信号通路在PCNSL中有促进肿瘤增殖的作用。

[1] COMMINS D L. Pathology of primary central nervous system lymphoma[J]. Neurosurg Focus, 2006,21(5):E2.

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[3] LEGLER D F, LOETSCHER M, ROOS R S, et al. B cell-attracting chemokine 1, a human CXC chemokine expressed in lymphoid tissues, selectively attracts B lymphocytes via BLR1/CXCR5[J]. J Exp Med, 1998,187(4):655-660.

[4] CACCAMO N, TODARO M, LA MANNA M P, et al. IL-21 regulates the differentiation of a human γδ T cell subset equipped with B cell helper activity[J]. PLoS One, 2012,7(7):e41940.

[5] HUSSAIN S K, ZHU W, CHANG S C, et al. Serum levels of the chemokine CXCL13, genetic variation in CXCL13 and its receptor CXCR5, and HIV-associated non-hodgkin B-cell lymphoma risk[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2013,22(2):295-307.

[6] SMITH J R, BRAZIEL R M, PAOLETTI S, et al. Expression of B-cell-attracting chemokine 1 (CXCL13) by malignant lymphocytes and vascular endothelium in primary central ner-vous system lymphoma[J]. Blood, 2003,101(3):815-821.

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(本文编辑 马伟平)

EXPRESSIONS OF CXCR5 AND ITS LIGANDS CXCL13 IN PRIMARY CENTRAL NERVOUS SYSTEM LYMPHOMA

TANWeiguo,WANGWenhua,ZHOUYouxin,DUZiwei

(Department of Neurosurgery, Kunshan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Kunshan 215300,China)

ObjectiveTo detect the expressions of chemokine receptor CXCR5 and its ligands-chemokine CXCL13-in primary central nervous system lymphoma (PCNSL) and their possible role in the occurrence and development of this disease.MethodsApplying immunohistochemical and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), the expressions of CXCR5 and CXCL13 in five cases of PCNSL and 10 cases of normal brain tissue were detected.ResultsImmunohistochemistry indicated that the expressions of CXCR5 and CXCL13 in tumor tissue were 100%(5/5), and 0 in normal brain tissue; RT-PCR showed CXCR5 and CXCL13 were all positive in the tumor tissue, and that in the normal brain tissue were negative.ConclusionCXCR5/CXCL13 signaling path plays an important role in the pathogenesis of primary central nervous system lymphoma.

central nervous dystem neoplasms; lymphoma; receptors, chemokine; CXCL13

2014-05-19;

2014-07-30

谭卫国(1978-)，男，硕士，主治医师。

R739.4

A

1008-0341(2015)01-0034-03