郁博，张斌，苏磊，潘敏，臧运书，陈宏泉

(1 青岛大学附属医院皮肤科，山东 青岛 266003； 2 第三军医大学新桥医院皮肤科)



皮肤黑素瘤细胞3种Smad的表达

郁博1，张斌2，苏磊1，潘敏1，臧运书1，陈宏泉1

(1 青岛大学附属医院皮肤科，山东 青岛 266003； 2 第三军医大学新桥医院皮肤科)

目的 探讨Smad2、Smad3、Smad4在皮肤黑素瘤细胞中的表达情况。方法 应用反转录-实时荧光定量PCR方法和蛋白印迹方法，分别检测人皮肤黑素瘤A375细胞和人正常黑素细胞中Smad2、Smad3、Smad4的mRNA及蛋白表达。结果 A375细胞中Smad2、Smad3、Smad4的mRNA和蛋白表达均显著低于人正常黑素细胞(t=2.361～4.214，P<0.01)。结论 在黑素瘤细胞的转化生长因子β(TGF-β)/Smad信号通路中Smad2、Smad3、Smad4均出现表达下调，可能参与了皮肤黑素瘤发病。

黑素瘤；黑素细胞；转化生长因子β；Smad蛋白质类

皮肤黑素瘤在皮肤肿瘤的致死率排名中一直高居首位，一旦发生转移预后极差，总体5年生存率<5%。转化生长因子β (TGF-β)/ Smad信号途径与皮肤癌等肿瘤的发生发展密切相关，皮肤是TGF-β作用的重要靶器官之一。目前的研究表明， TGF-β/Smad信号通路中的TGF-β、TGF-βRⅡ以及某些Smad蛋白成分在恶性黑素瘤组织中表达异常[1-2]，提示TGF-β/Smad信号转导途径的改变可能参与了黑素瘤的发生和发展。本研究对体外培养的人皮肤黑素瘤A375细胞中受体活化Smad(Smad2、Smad3)和共有Smad(Smad4)的表达进行了检测。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞 人黑素瘤A375细胞系(以下简称A375细胞)购自中国科学院上海细胞生物研究所。

1.1.2主要试剂及仪器 DMEM培养液(购自美国Gibco公司)，胎牛血清(天津灏洋生物制品科技责任有限公司)，PrimeScriptTMRT Reagent Kit试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTM(日本TaKaRa Bio株式会社)，鼠抗人Smad2/3单克隆抗体sc-7960、兔抗人p-Smad2/3多克隆抗体sc-1176以及鼠抗人Smad4单克隆抗体sc-7966(美国Santa Cruz 生物技术公司)，兔抗人肌动蛋白(β-Actin)多克隆抗体(北京中杉金桥公司)。Chemi ImagerTM 5500型凝胶成像分析仪(美国Alpha Innotech公司)，DU 800核酸-蛋白检测仪(美国Beckman Coulter公司)，7500 Real Time 荧光定量PCR反应扩增仪(美国Applied Biosystems公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 参照文献的方法，取健康成年人包皮进行消化、分离提取人皮肤黑素细胞(以下简称NM细胞)[3]。NM细胞、A375细胞置含体积分数0.05的CO2孵箱中，在37 ℃、饱和湿度环境下，用含体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养液培养，每2 d更换1次培养液。

1.2.2反转录-Real-Time荧光定量PCR检测 细胞总RNA提取参照Trizol(Invitogen公司)说明书操作步骤进行，并对所抽提的细胞总RNA质量进行验证。依据荧光定量PCR引物设计原则[4]设计引物。Smad2引物：上游5′-TTCCAGACTTTGT-GCTGTCCAGTAA-3′，下游5′-AGGGCAGAGGC-TCCACTGAGTA-3′，扩增片段长度120 bp；Smad3引物：上游5′-AAACCAGGCTGGCTAAACAAGT-G-3′，下游5′-GCAACAGCAGCAGTGAAGGTG-3′，扩增片段长度179 bp；Smad4引物：上游5′-GGAC-CGGATTACCCAAGACAGA-3′，下游5′-CTGCA-ATCGGCATGGTATGAAG-3′，扩增片段长度为112 bp；GAPDH引物：上游5′-GCACCGTCAAG-GCTGAGAAC-3′，下游5′-ATGGTGGTGAAGAC-GCCAGT-3′，扩增片段长度142 bp。根据反转录Reagent Kit试剂盒说明书反转录合成cDNA，42 ℃ 15 min、95 ℃ 2 min使反转录酶失活，所得cDNA产物保存于-20 ℃冰箱中备用。Real-Time PCR反应体系50 μL，内含模板cDNA 200 ng。扩增条件：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共进行40个循环。分别设置融解曲线检测融解温度，以验证产物的特异性。Real-Time PCR检查结果采用2-△△CT值表示[4]，其中△CTSmad=CTSmad-CTGAPDH，△△CT=△CTA375-△CTNM。

1.2.3Western blotting检测 参考文献的方法进行操作[5]。分别取A375细胞和NM细胞的总蛋白40 μg，上样至100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，电泳结束后，电转到PVDF膜上，再用体积分数0.05的脱脂奶粉室温下封闭60 min，TBS洗膜，分别加入用BSA稀释的第一抗体(1∶200)，4 ℃孵育过夜后，TBS洗膜，加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育1 h，TBST洗膜，DAB显色。Smad蛋白的相对表达量以Smad与β-Actin条带的光密度比值表示。

1.3统计学处理

2 结 果

2.1细胞中受体活化Smad mRNA的表达

与A375细胞(设为1)相比，NM细胞Smad2、3 mRNA的2-△△CT值分别为3.533±0.224和8.371±0.230， A375细胞Smad2、3 mRNA的表达水平显著低于NM细胞。

2.2细胞中受体活化Smad蛋白的表达

NM细胞与A375细胞Smad2/3蛋白的相对表达量分别为0.274±0.055和0.158±0.112，p-Smad2/3蛋白相对表达量分别为0.602±0.095、0.159±0.081，A375细胞中Smad2/3和p-Smad2/3蛋白的表达明显低于NM细胞(n=9，t=2.361、4.214，P<0.05)。见图1。

2.3细胞中共有Smad mRNA的表达

与A375细胞(设为1)相比，NM细胞Smad4 mRNA 2-△△CT值为4.695±0.362， A375细胞中Smad4 mRNA表达水平显著低于NM细胞。

2.4细胞中共有Smad蛋白的表达

NM细胞与A375细胞Smad4蛋白相对表达量分别为0.477±0.072和0.152±0.121，A375细胞中Smad4蛋白的表达明显低于NM细胞(n=9，t=3.522，P<0.01)。见图2。

图1 Western blotting检测A375细胞与NM细胞Smad2/3及p-Smad2/3蛋白的表达

图2 Western blotting检测A375细胞与NM细胞Smad4蛋白的表达

3 讨 论

Smad蛋白家族是TGF-β超家族信号转导分子，在TGF-β/Smad受体下游的信号传导途径中起关键调控作用。根据其功能的不同可以分为3类：①受体活化Smad蛋白，主要包括Smad1～Smad3、Smad5和Smad8等，其中Smad2和Smad3介导TGF-β1和激活素的信号，Smad1、Smad5、Smad8则介导骨形态发生蛋白(BMP)的信号；②共有Smad蛋白，即Smad4，该蛋白参与所有TGF-β家族成员的信号转导；③抑制性Smad蛋白，主要有Smad6和Smad7，是TGF-β/Smad信号转导通路负性调节因子，主要通过阻断受体活化Smad蛋白与TGF-β受体或共有Smad蛋白的结合发挥作用[6]。

TGF-β/Smad信号传导通路中的多项异常与一些不同病理类型实体肿瘤细胞(如胃肠癌、肝癌、肺癌、食管癌)的发生发展有着密切的关系。既往研究结果显示，MDH4(编码Smad4蛋白)在肿瘤中频发突变，其中在胰腺癌、结直肠癌中Smad4基因突变频率较高，基因的突变和缺失引起Smad4蛋白失活[7]。MADH2 (编码Smad2蛋白)在某些肿瘤中有一定突变，肺癌中也发现了Smad2基因的突变，但突变频率要低于Smad4基因。在直肠癌、头颈部肿瘤中均发现Smad2突变，肝细胞癌存在Smad2和Smad4基因突变。在Smad2和Smad4的MH2结构域经常发生点突变和移码突变，产生早熟的蛋白。Smad4的MH2结构域突变破坏了蛋白的核心结构，从而不能形成Smad蛋白复合体，阻断了受体依赖的受体活化Smad蛋白磷酸化作用或产生不稳定的Smad蛋白，并可以引发MH1和MH2亲和力增加，进而阻滞TGF-β对癌细胞的抑制作用[8]。

目前研究结果显示，TGF-β/Smad信号通路中TGF-β、TGF-βR及部分Smad蛋白成分在恶性黑素瘤组织中表达异常[1-2]。本研究结果显示，体外培养的人黑素瘤A375细胞出现TGF-β受体活化Smad(Smad2、3)及共有Smad(Smad4)表达水平的下调。在TGF-β/Smad信号通路中，细胞内的受体活化Smad是否正常表达是TGF-β信号能否顺利传导的关键因素。如果Smad2、3表达水平降低或缺失，会加剧TGF-β/Smad信号下传受阻。而Smad4可以与Smad2、3发挥协同作用，共同参与调节TGF-β/Smad信号的下传。一旦出现细胞Smad4表达的下调或缺失时，也可以干扰TGF-β信号的下传。失去TGF-β抑制作用的黑素瘤细胞在癌基因启动和抑癌基因功能丧失等其他多种相关因素的参与下，可出现异常的失控性增殖，导致黑素瘤细胞病理改变的形成。

[1] 李鹏程,张虹,丁正平,等. TGF-βR Ⅱ和Smad4蛋白在葡萄膜黑色素瘤中的表达[J]. 肿瘤防治研究, 2005,32(1):35-36.

[2] 武犁,邢怡桥,李鹏程,等. TGF-β1/TGF-βRⅡ和Smad4在葡萄膜黑色素瘤中的表达[J]. 眼科新进展, 2005,25(3):240-241.

[3] 徐前喜,杜娟,朱铁君,等. 体外培养正常人黑素细胞TGF-β1及其Ⅰ型受体的表达[J]. 中国麻风皮肤病杂志, 2006,22(5):353-355.

[4] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 (-Delta Delta C(T)) Method[J]. Methods, 2001,25(4):402-408.

[5] 郁博,何威,张斌,等. 肿瘤坏死因子-α对角质形成细胞株HaCaT细胞糖皮质激素受体表达的影响[J]. 临床皮肤科杂志, 2010,39(5):279-282.

[6] MALHOTRA N, KANG J. SMAD regulatory networks construct a balanced immune system[J]. Immunology, 2013,139(1):1-10.

[7] OKUGAWA Y, INOUE Y, TANAKA K, et al. Smad interacting protein 1 (SIP1) is associated with peritoneal carcinomatosis in intestinal type gastric cancer[J]. Clin Exp Metastasis, 2013,30(4):417-429.

[8] 西永明,贾连顺,赵鹏,等. Smad蛋白在BMP-2诱导成骨分化过程中的作用[J]. 青岛大学医学院学报, 2007,43(6):482-484.

(本文编辑 马伟平)

EXPRESSIONS OF THREE KINDS OF SMAD IN CUTANEOUS MELANOMA

YUBo,ZHANGBin,SULei,PANMin,ZANGYunshu,CHENGHongquan

(Department of Dermatology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the expressions of Smad2, Smad3 and Smad4 in cutaneous melanoma.MethodsReverse transcription-real time polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting were utilized to detect the expressions of A375 cell line in cutaneous melanoma and Smad2, Smad3 and Smad4 in normal melanocytes.ResultsThe expressions of Smad2, Smad3 and Smad4 mRNA of A375 cells line were significantly lower than human normal melanocytes (t=2.361-4.214,P<0.01).ConclusionIn TGF-β/Smad signaling pathways, the down regulation of Smad2, Smad3 and Smad4 may involve in the pathogenesis of cutaneous melanoma.

melanoma; melanocytes; transforming growth factor beta; Smad proteins

2014-07-02;

2014-09-18

山东省科技发展计划项目(2011YD18012)，山东省自然科学基金项目(ZR2010HM022)，山东省中医药科技项目(2011-199)

郁博(1976-)，男，博士，主治医师。

臧运书(1963-)，男，硕士，教授，硕士生导师。

R739.5

A

1008-0341(2015)01-0026-03