赵振营,安荣泽

(遵义医学院 第五附属(珠海)医院,广东 珠海 519100)

骨髓基质干细胞移植治疗骨不连进展

赵振营,安荣泽

(遵义医学院 第五附属(珠海)医院,广东 珠海 519100)

摘要：骨髓基质干细胞移植(BMSCs)治疗骨不连是现研究的热点之一，随着对BMSCs功能及调控因子的深入研究，同时结合组织工程和基因工程技术，开创了骨不连治疗的新方向,并在临床及动物实验中取得了一定成果。我们就BMSCs移植治疗骨不连的现有研究做简要综述。

关键词：骨不连;骨髓基质干细胞;支架;转染

中图分类号：R683

文献标识码：识码： A

文章编号：编号： 1672-7606(2015)01-0073-04

收稿日期：2014-09-12

作者简介：赵振营(1971-)，男，河南开封人，硕士，副主任医师，从事骨与关节损失的诊治和研究工作。

Abstract:Bone marrow stromal cell transplantation is one of the research hotspots of treatment of nounion. With the far study of the function and regulatory factors of BMSCs, and the helping of tissue engineering and gene engineering technology, stromal cell transplantation create a new era for the treatment of nonunion and has achieved some results in pre-clinical and clinical experiments. In this paper,we make a brief review on it.

The research on the function of bone marrow stormal cell transplantation to nonunion

ZHAO Zhenying, AN Rongze

(ZunyiMedicalCollege,theFifthAffiliatedHospital,Zhuhai,Guangzhou519100,China)

Key words: nonunion; bone marrow stromal cells; cell scaffold; transfection

骨不连是一个复杂的病理现象，是骨科医师面临的难题之一，纵然现代医学对其病因、病理研究不断深入，但本质上还停留在试验与推测的阶段。目前治疗最有效的方法仍以手术为主，包括病变切除、内固定、外固定、骨移植及各方法的联合运用。当下，以骨髓基质干细胞(BMSCs)为基础的治疗策略引起人们越来越多的兴趣，并取得了一定的临床试验结果。

1骨不连的诊断

骨不连是指骨的正常愈合过程终止。目前为止无统一定义， 美国食品和药品临督管理局(FDA)定义骨不连：骨折后至少9 mon，且连续3 mon无任何愈合迹象[1]。曾炳芳[2]总结认为：骨不连有两个基本要素即：①骨折后6~9 mon骨折仍未愈合；②已经连续观察3 mon骨折没有愈合的迹象。其发生受全身因素如年龄、激素、药物、营养等及局部因素如生物活性因子、血供等影响。可以说在骨折愈合的复杂过程中一个或多个阶段受阻，如骨缺损大、BMSCs数量不足、诱导物含量低等都必然导致骨不连[3]。目前,骨不连诊断主要依据影像学检查，X线检查提示骨折间隙明显、骨折端硬化、骨折面光滑及假关节形成即可诊断。CT扫描能更好显示内固定物因X线不透视而遮挡的部分。MRI增强扫描可以发现骨折端新生血管及成骨情况，同时了解周围韧带或软组织病变，具备一定优势。在临床上，早期诊断骨不连具有重要意义。骨髓腔造影技术能显示断端骨痂内静脉通过情况，超过10周仍无血管通过或无造影剂通过血管，即提示骨折延迟愈合或有延迟愈合可能。但此检查为有创检查，不能普及。超声检查可以早期预测骨折愈合倾向，有研究认为超声检查诊断早期骨不连阳性预测值达97%，但此技术过度依赖超声医师的技术和经验。核素扫描可以反映骨折端血流及骨代谢情况，可以评价骨不连处的骨血运、感染和滑膜假关节形成。虽然此检查敏感性强，但特异性差，难以准确定位，因而只能作为功能性检查。目前能被认可的骨不连早期诊断手段仍然只有高分辨率CT。随着混合型影像装置和显像技术发展，SPECT/CT图像融合技术为骨不连早期诊断提供更有力工具， 可能为早期诊疗骨不连带来一场变革[3]。我们期待更多的研究报道。

2骨不连的病理及分型

骨不连在病理上表现为：①髓腔骨性的闭塞；②髓腔内纤维化；③接触骨的纤维组织和骨折间隙内可以看到类软骨性骨化和纤维性骨化[4]。微观结构表现为骨折断端存在被胶原纤维小板间隔成空腔样的骨小梁结构，小梁和纤维板的胶原只被羟基磷灰石轻微钙化。根据不同组织学特点，可将其分为萎缩性、肥大性、滑膜假关节及感染性骨不连[5]。临床上还可见骨缺损性及营养不良性骨不连。各种类型在其血供、骨活性方面均有不同，诊疗中应予以区别治疗。

3BMSCs治疗骨不连的应用

骨折愈合是一个非常复杂的过程，从细胞水平来看，包括细胞募集、诱导、调控、骨传导。骨折发生后,临近及全身的成骨性干细胞募集于骨折处,骨折局部的骨生长因子分泌增多,诱导干细胞向成骨细胞分化,出现骨再生,进而依据Wolff定律进行骨改造与塑形。相关研究已证实在骨折的愈合过程中BMSCs起着重要的作用，具有较强的增殖能力和向多种间充质细胞分化的潜能 ,可向成骨系细胞方向分化。但BMSCs如何被精确诱导分化成骨前体细胞，目前仍不清楚，已知的是微循环状态、缺氧等物理因素可能是其诱导分化的重要因素[6-7],而局部微环境是主要影响因素[8]。BMSCs的定向诱导成骨已知的具有诱导作用生长因子有骨形态发生蛋白(BMP)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)。在正常的骨折愈合过程中，BMSCs在调控因子的帮助下增殖、分化为成骨细胞，最终形成骨而修复骨损伤。因在体内存在广泛，对机体损伤小、体外培养增值力强、易于向成骨细胞分化且成骨性能稳定等特点，是骨折修复和再生修复骨不连与骨缺损的研究热点。

3.1　经皮自体BMSCs移植

骨髓血中含有骨髓基质细胞，通过髂骨取髓，注入骨不连断端，能促进成骨，效果肯定，但骨髓内干细胞含量低，数量不足。相关研究[9]认为移植的BMSCs浓度应>1 000/mL，总数应>30 000。若非使用富集方法，难以移植所需BMSCs量，此可能影响干细胞移植疗效，导致治疗失败。

取少量骨髓后经体外纯化、扩增BMSCs，达到一定量级后注入骨不连部位，可以解决数量不足问题。童培建[10]等经皮注射BMSCs治疗四肢骨不连48例，随访3~8 mon，成功治愈42例。张传开[11]等治疗四肢骨折骨不连患者41例，术后随访9～24 mon，骨折愈合39 例。Johner-Wruhs 功能分级法评定患肢恢复情况，疗效为优25例、良9例、可5例、差2例。王玉龙[12]等通过自体骨髓干细胞移植治疗开放性损伤、局部皮肤软组织条件差的胫骨骨折骨不连患者11例，随访时间为4～27 mon，X线片显示骨折愈合良好，未见不良事件的发生。观察到体外培养扩增3周并未影响 MSCs 成骨能力。根据干细胞特性，相关临床证实BMSCs移植联合高压氧、冲击波、电刺激等治疗骨不连也取得良好效果。其前提是要解决导致骨不连的技术性、生物性因素，如感染、固定不牢及成骨障碍、复位不佳等。

因BMSCs没有免疫原性或免疫原性低，仅表达低水平的组织相容性复合体(MHC)-1。动物实验已证实: 全身或局部注入人胚胎 MSCs 和 MSCs 很少发生移植排斥反应。且异体BMSCs移植治疗骨缺损在兔试验中取得一定成果，在未来可能为BMSCs提供更多来源。

3.2　自体BMSCs复合生物材料支架植入

BMSCs为液性物质，在缺损性骨不连、断端间隙大于5 mm或坚韧疤痕组织、硬化骨痂封闭断端时，很难保证BMSCs在局部聚集而发挥作用。自体骨或异体骨移植可以为之提供支撑及修补缺损作用，临床研究证实此方法疗效良好。从理论出发，添加各种生长因子的生物材料支架复合自体骨髓基质干细胞植入应更有效的促进骨不连愈合。在这个组织工程系统里，细胞在一个多孔的三维支架系统中保持活性状态。目前已研发的支架类型包括天然物合成支架，如壳聚糖、胶原、透明质酸等; 人工合成高分子支架，如碳纤维支架; 覆盖生物分子的支架，如具生长因子支架等。在BMSCs复合不同支架材料修复骨缺损的大量研究中发现，其修复骨缺损的具体机制可能为[13]:①局部提供高浓度MSCs促进成骨;②促进植入缺损处局部微血管形成，便于新骨生长;③通过释放成骨因子促进原始骨祖细胞分化，提高生物支架材料的骨诱导能力。动物实验已经证明磷酸钙、羟基磷灰石及复合材料、藻酸钙、珊瑚等分别与BMSCs复合治疗骨缺损或骨不连，与空白组对照显示复合组有明显的促进修复骨缺损的作用。扈延龄[14]等将复合重组人骨形态发生蛋白-2 (rhBMP-2)壳聚糖微球的可注射磷酸钙骨水泥在体外与青山羊骨髓干细胞共同培养，与单纯磷酸钙骨水泥和单纯壳聚糖微球磷酸钙骨水泥材料组对比，发现负载rhBMP-2壳聚糖微球磷酸钙骨水泥复合材料的新骨形成优于其他组。Borden 等[15]在新西兰白兔尺骨骨不连模型中通过对比单独多聚微球基质组、 多聚微球基质+自体骨髓组、多聚微球基质+20 ug BMP-7组、多聚微球基质+20 ug BMP-7+自体骨髓组，发现BMP-7能诱导新骨长入多聚微球基质，使骨髓基质干细胞的成骨活性增强，即BMP-7结合干细胞成骨能力更强。Quarto 等[16]对3例不同部位骨缺损患者，包含一个胫骨骨折、一个肱骨和两个尺骨骨折。将扩增的BMSCs复合含有羟基磷灰石空的陶瓷支架植入骨缺损处，随访后发现骨缺损处有大量的骨痂生成，新生骨质与原有的骨质很好地融合。姚旺祥[17]等使用浓缩自体骨髓复合纤维蛋白胶修复骨缺损及骨不连16 例，通过电镜下观察认为纤维蛋白胶与骨髓有核细胞生物相容性良好，长期培养无致瘤性。随访的15例患者13 例患者骨折治愈。2 例因初始损伤为开放性骨折，骨折端软组织覆盖欠佳，且多次手术使局部血运破坏较大而不愈合。

3.3　运用基因工程改造BMSCs

为保证局部BMSCs持续向成骨细胞转化，需要多次在不愈合端注射骨髓或BMSCs。而通过基因工程则可避免细胞正常衰老、反复给药及外源生长因子所致过敏反应，同时能持续诱导BMSCs向成骨细胞转化。其方法是：①将含有诱导成骨的目的基因导入干细胞中，使之表达并合成有骨诱导作用的生长因子;②将外源性人端粒酶反转录酶(hTERT)基因导入BMSCs，消除衰老，使之维持增殖。

郝伟等[18]将携带 rhBMP-2及bFGF 基因片段的双基因表达载体 prh-BMP-2-IRES-bFGF 并转染兔 BMSCs，与rhBMP-2及bFGF单独转染组、未干预 BMSCs 组设为对照，4周后发现在 rh-BMP-2-bFGF/BMSCs 组有骨小梁样结构的编织骨组织形成，可以观察到骨细胞、成骨细胞、破骨细胞等分化结构。陈剑等[19]将BMP-2和BMP-7基因通过腺病毒载体转染入兔骨髓间充质干细胞，与空白组、单独BMP-2、BMP-7转染组对比，第7 d，联合转染组Runx-2、Osx、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶mRNA表达，均较其他各组明显增高。4个检测指标基因mRNA表达第14天均高于第7天。提示转染后更能促进成骨相关基因和蛋白表达。 滕勇等[20]采用脂质体转染法将人端粒酶反转录酶(hTERT)基因导入单克隆培养的人骨髓基质干细胞，筛选阳性克隆体，体外扩增培养，取第100代细胞进行诱导分化,结果显示其能向成骨、软骨及心肌细胞分化。

4前景与面临的问题

BMSCs移植与再次手术结合植骨治疗骨不连相比有一定优势:来源广泛，取材方便，治疗时创伤轻，患者痛苦小，操作简单安全。但在干细胞提取、扩增、培养过程中存在诸如技术、安全风险、伦理学问题，预防移植部位的异位骨化问题，同时明确适应证、最佳施行时间、治疗剂量有待解决。支架材料植入及基因转染现仍以体外及动物实验为主，如何提高其效率和安全性， 降低免疫源性、 提高转染效率和可操作性等使之运用于临床言之尚早。BMSCs在诱导分化时与各种细胞因子或化学物质之间的作用还不完全清楚，尚不足以完全阐述分化的真正机制，如何控制增殖分化的速度，又避免形成肿瘤，保证MSCs的同质性仍需进一步研究。干细胞研究领域在治疗骨不连和骨折愈合治疗策略方面具有巨大的潜力，随着组织工程发现及成骨诱导机制进一步发展，相信在未来干细胞移植治疗骨不连、骨缺损具有非常光明的前景。

参考文献：

[1] Rodriguez-Merchan E C, Forriol F. Nonunion:general principles and experimental data[J]. Clin Orthop Relat Res. 2004,419:4-12.

[2] 曾炳芳，康庆林. 四肢骨不连外科学[M]. 北京：人民军医出版社,2010.

[3] 常玉立，刘智，孙天胜.骨不连及其干细胞移植疗法的研究进展-感染.炎症.修复.2007,8(3):182-185.

[4] 刘傥，曹轶. 骨不连的病理学研究进展.中国矫形外科杂志[J].2010,18(12):1 006-1 007.

[5] Sanchez M, Anitua E, Cugat R, et al. Nonunions treated with autologous preparation rich in growth factors[J]. J Orthop Trauma, 2009,23(1):52-59.

[6] Holzwarth C,Vaegler M,Gieseke F,et al.Low physiologic oxygen tensions reduce proliferation and differentiation of human multipotent mesenchymal stromal cells[J]. BMC Biol, 2010,11(1):11.

[7] Araldi E,Schipani E. Hypoxia， HIFs and bone development[J]. Bone, 2010,47(2):190-196.

[8] Khosla S, Westendorf J J, Modder UI. Concise review:Insights from normal bone remodeling and srem cell-based therapies for bone repair[J]. Stem Cells, 2010,28(12):2 124-2 128.

[9] Hernigou P，Piognard A，Beaujean F. Percutaneous autolo gousbone marrow grafting for nonunions [J]. J Bone Joint Surg(Am)， 2005，87：1 431-1 437.

[10] 童培建，厉驹，瞿杭波．经皮自体骨髓间充质干细胞移植治疗四肢骨折骨不连[J].中华创伤杂志，2007，23(7):499-501．

[11] 张传开，史 跃，刘 英，等.经皮自体骨髓间充质干细胞移植术治疗四肢骨折骨不连 41 例[J].山东医药, 2012,52 (2):95-96.

[12] 王玉龙, 王明贵, 贺小兵，等.自体骨髓干细胞移植治疗胫骨骨折骨不连[J].局解手术学杂志,2014,23(2):131-134.

[13] 俞猛，夏仁云.骨髓间充质干细胞在骨组织工程中的应用进展闭[J].中国骨肿瘤骨病，2006，5(6):367一371.

[14 ] 扈延龄,李红,李树娟,等. 复合rhBMP-2壳聚糖微球可注射磷酸钙骨水泥制备及成骨性能研究[J].中国矫形外科杂志，2010,18(20):1 723-1 726.

[15] Borden M , Attawia M , Khan Y, et al. Tissue-engineeredbone formation in vivo using a novel sintered polymeric microsphere matrix[J]. Bone Joint Surg Br, 2004,86 (8):1 200-1 208.

[16] Quarto R, Mastrogiacomo M, Cancedda R, et al. Repair of large bone defects with the use of autologous bone marrow stromal cells. N Engl J Med, 2001,344(5):385-386.

[17] 姚旺祥，朱六龙，徐建生. 浓缩骨髓复合纤维蛋白胶对骨不连的修复[J].中华全科医学,2014,12(3):350-352.

[18] 郝伟, 姜明,等. rhBMP-2、bFGF 双基因共转染兔骨髓间充质干细胞复合 nHA/RHLC/PLA 支架及其体内外成骨分化研究[J].中国矫形外科杂志, 2011，19(13):1 130-1 134.

[19] 陈剑，袁文,等.骨形态发生蛋白2和7共转染骨髓间充质干细胞的成骨分化[J].中国组织工程研究,2012,16(49):9 139-9 145.

[20] 滕勇,胡蕴玉,等.端粒酶反转录酶基因介导的人骨髓基质干细胞永生化研究[J].解放军医学杂志，2010,35(10):1 230-1 234.

[责任编辑李麦产]