谢欣梅，王　琳，赵　艳，陈若芸，庞晓斌*，杜冠华*

(1. 河南大学 药物研究所，河南 开封 475004；2. 青岛市市立医院 山东 青岛 266011；3. 中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所 国家药物筛选中心，北京 100050)

消栓通络有效成分组对大鼠脑缺血损伤的保护作用及其机制

谢欣梅1，王琳1，赵艳2，陈若芸3，庞晓斌1*，杜冠华3*

(1. 河南大学 药物研究所，河南 开封 475004；2. 青岛市市立医院 山东 青岛 266011；3. 中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所 国家药物筛选中心，北京 100050)

摘要：目的研究消栓通络有效成分组(XECG)对大鼠脑缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用及其机制。方法SD大鼠随机分为6组：假手术组，模型组，尼莫地平对照组(4 mg·kg-1)，XECG高、中、低剂量组(200、100、50 mg·kg-1)。采用线栓法阻断大脑中动脉(MCAO)建立大鼠脑缺血/再灌注(I/R)模型。缺血2 h，再灌注24 h后，HE染色观察大鼠缺血侧脑组织的病理变化；Western blot法检测缺血侧脑组织肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β (Interleukin 1β，IL-1β)的表达。结果XECG能明显改善缺血再灌注大鼠脑组织的病理变化，降低缺血侧脑组织TNF-α、IL-1β的表达。结论XECG对脑缺血再灌注大鼠具有明显的保护作用，其机制可能与降低TNF-α、IL-1β的表达，抑制炎症级联反应有关。

关键词：XECG；脑缺血/再灌注；炎症反应

中图分类号：R743.3

文献标识码：A

文章编号：号： 1672-7606(2015)01-0006-04

收稿日期：2014-09-12

基金项目：国家自然科学基金资助项目 (81273652)。

作者简介：谢欣梅(1973-)，女，内蒙古乌兰浩特人，硕士，讲师，从事药理学与药效学评价的教学与科研工作。

通讯作者：*庞晓斌(1973-)，男，河南洛阳人，博士，副教授，从事中药药效物质基础与作用机制研究工作；杜冠华(1956-)，男，山东滕州人，研究员，博士生导师，从事药物发现的理论和技术研究工作。

Abstract:ObjectiveTo observe the protective effect and mechanism of effective components group of Xiaoshuantongluo (XECG) on ischemia/reperfusion (I/R) injury in rats.MethodsHealthy male adult Sprague Dawley rats were randomly divided into the sham operation group，the model group, the nimodipine (4 mg·kg-1) group, and high, middle and low dose XECG groups (200, 100, 50 mg·kg-1). Middle cerebral artery occlusion was adopted to establish the rat ischemia / reperfusion model. After ischemia for 120 min and reperfusion for 24 h，the pathological injury of the ischemia side was observed by HE staining. Expressions of tumor necrosis factor α(TNF-α), Interleukin 1β (IL-1β) were detected by western blotting technique. ResultsXECG could significantly improve the pathological changes of cortical penumbra brain tissues, Compared with the I/R model group, XECG could significantly inhibit expressions of TNF-α、IL-1β. Conclusion XECG has obviously protective effect on Sprague Dawley rats after cerebral ischemia and reperfusion, its mechanisms may be associated with inhibiting inflammatory，expression of TNF-α and IL-1β proteins.

Protective effects and mechanism of effective components group of Xiaoshuantongluo on cerebral ischemia injury in rats

XIE Xinmei1, WANG Lin1, ZHAO Yan2, CHEN Ruoyun3, PANG Xiaobin1*, DU Guanhua3*

(1.InstituteofPharmacy,HenanUniversity,Kaifeng,Henan475004,China；2.QingdaoMunicipalHospital,Qingdao,Shandong266011,China；3NationalCentreforPharmaceuticalScreening,InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

Key words: XECG; ischemia/reperfusion; Inflammation

中风是一种急性脑血管疾病，大约80%以上的中风是因脑血管栓塞所致的缺血引起，目前尚无有效治疗药物[1-3]。因此，寻找有效治疗中风的药物具有重要意义。

消栓通络方出自北京同仁堂传统秘方，由川芎、丹参、黄芪、泽泻、三七、槐花、桂枝、郁金、木香、冰片、山楂共11味中药根据中医药理论配伍而成，具有活血化瘀、温经通络之功效，在中风病的防治中发挥了重要作用[4,5]。消栓通络有效成分组 (the effective components group of Xiaoshuantongluo, XECG) 是从消栓通络方中经分离提取获得的多种有效成分组合，具有抑制血栓形成，改善脑血流，抑制血管内皮细胞损伤等功能[6,7]。缺血性脑损伤的发病机理众多，炎症反应是脑缺血疾病发生发展的重要作用机制之一，在脑缺血及再灌注损伤过程中，炎症细胞因子导致脑组织炎症反应[8-10]。另外，炎症损伤机制又可继发其他损伤机制，这些因素相互关联，互为因果，最终导致了缺血性脑损伤的发生发展，因此，对于炎症反应的防治在减轻脑损伤中有着极为重要的意义。

本实验采用大脑中动脉内线栓法( middle cerebral artery occlusion，MCAO)建立大鼠脑缺血再灌注(ischemia / reperfusion，I/R)模型[11,12]，通过观察缺血区脑组织病理变化以及缺血再灌注后炎性介质的表达，探讨消栓通络有效成分组对脑缺血再灌注大鼠脑损伤的保护作用及其机制。

1实验材料

1.1　实验动物

成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF级，体质量280～300 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号 SCXY(京) 2012-0007。实验过程中大鼠的饲养环境稳定，室温(25±2) ℃，相对湿度(55±5)%，灯光控制12 h昼夜交替。对实验动物的所有操作均符合中国实验动物伦理学的要求。

1.2　药物与试剂

消栓通络有效成分组(XECG)(中国医学科学院药物研究所陈若芸研究员提供)；尼莫地平片(山西亚宝药业集团股份有限公司，批号:100702)；兔抗鼠TNF-α抗体、兔抗鼠IL-1β抗体购自Santa-Cruz公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG 抗体购自美国Pierce Biotechnology公司；SABC免疫组化染色试剂盒和DAB显色剂购于武汉博士德生物技术研究所。

1.3　主要仪器

显微镜 SZX16型 (日本 Olympus 公司)；冰冻切片机(莱卡，德国)；PowerGen 125型组织匀浆机(赛默飞世尔公司)；GS-15R离心机(Beckinan公司，美国)。

2方法

2.1　实验动物分组及处理

成年健康雄性SD大鼠，随机分为假手术组、缺血再灌注模型组、尼莫地平给药组(4mg·kg-1)、XECG高、中、低剂量组(200，100，50 mg·kg-1)，每组 10只。各组分别于再灌注即刻灌胃给药，假手术组与模型组分别给予等量生理盐水。

2.2　大脑MCAO法建立大鼠脑缺血/再灌注(I /R )模型

SD大鼠术前12 h禁食，质量分数为10%水合氯醛(350 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，仰卧位固定。参照Longa等的大脑中动脉线栓法，造成左侧大脑中动脉阻塞。缺血2 h后，将栓线向外拉出至颈内实现再灌注。假手术组只进行术前麻醉和血管分离术，不结扎及导入线栓。

2.3　神经功能评分

再灌注24 h后进行大鼠神经行为学观察。参照Longa等的5级4分制：0分，无神经功能缺失症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，爬行时出现对侧转圈；3分，行走时向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。

2.4　组织病理切片的制备

大鼠于再灌注24 h 后，用质量分数为10%水合氯醛(350 mg·kg-1) 腹腔麻醉，开胸经心脏灌流生理盐水，然后以质量分数为4%多聚甲醛灌流固定，断头取脑，将脑组织放入质量分数为4%多聚甲醛继续固定48 h，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋处理，自视交叉后行冠状切片，层厚5 μm，常规HE染色。

2.5　Western blot检测TNF-α、IL-1β 的表达

I/R手术24 h后，质量分数为4%多聚甲醛灌注固定，断头取脑，冠状切取前囟前1.0 mm至前囟后3.0 mm的脑组织，进行匀浆。在冰上加蛋白裂解液裂解，然后在4 ℃下12 000 r·min-1离心5 min，进行蛋白含量的测定，SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，TNF-α(1∶500)、IL-1β(1∶200)、一抗 4 ℃下孵育 24 h后 TBST 洗涤 3 次；二抗37 ℃孵育1 h，ECL化学发光，暗室显影，定影，对胶片进行扫描与拍照并进行分析。

2.6　统计学方法

3结果

3.1　XECG对脑缺血再灌注大鼠神经症状的影响

再灌注24 h，各组大鼠无死亡，模型组大鼠表现出明显的神经功能缺损(P<0.01)，XECG给药组和尼莫地平组可明显减轻缺血再灌注造成的神经功能损害，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.05)。见表1。

与假手术组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05。

3.2　XECG对大鼠缺血侧脑组织病理学的影响

结果显示，假手术组神经元排列紧密，核仁清晰，结构完整，未见神经元变性、坏死及炎细胞浸润。模型组可见细胞排列散乱，神经元明显肿胀，毛细血管扩张充血，可见炎细胞浸润、嵌塞。XECG各剂量组、尼莫地平组与模型组相比，神经细胞排列趋于整齐，神经元变性程度较轻，坏死灶明显减少，炎症细胞浸润较轻，其中XECG中、高剂量组改善效果更明显。见图1。

3.3　XECG对大鼠缺血侧脑组织TNF-α、IL-1β 表达的影响

脑缺血/再灌注24 h后，缺血区皮层组织中细胞因子TNF-α、IL-1β 蛋白表达显著增加，XECG于缺血后早期给药对于TNF-α、IL-1β的表达均有不同程度的抑制作用。见图2。

4讨论

XECG是从消栓通络方中分离获得的多种有效成分组合制剂，研究表明XECG对血管系统和神经细胞具有保护作用。本文通过制备大鼠脑缺血再灌注动物模型，探讨XECG对脑缺血再灌注损伤的保护作用。结果表明，XECG可明显减轻脑缺血再灌注大鼠神经功能损害，显著改善缺血侧脑组织病理损伤，对脑缺血再灌注损伤具有明显保护作用。

炎症反应是脑缺血再灌注损伤级联反应的关键环节，炎性细胞因子TNF-α、1L-1β在其中起到重要的作用[13]。在生理状态下，炎性细胞因子只有低水平表达，而在缺血期间，炎症因子的表达上调。炎性因子一方面通过刺激其它细胞因子和炎症介质的产生，诱导损伤区白细胞浸润；另一方面可刺激内皮细胞表达黏附分子，促进白细胞在损伤区聚集，加剧微血管的闭塞、氧自由基的形成、细胞毒素酶的释放、血管收缩反应的改变等，增加内皮细胞通透性，加重缺血性脑损伤[14]。本实验通过Western blot法检测缺血脑组织炎性细胞因子TNF-α、IL-1β的表达，结果显示，模型组脑组织TNF-、IL-1β 的表达比假手术组显著升高，说明脑缺血再灌注损伤后出现的炎症反应加重了脑缺血损伤。与模型组相比，XECG各剂量组均能降低TNF-α、IL-1β 的表达，提示XECG对缺血再灌注损伤的保护作用与抑制炎性细胞因子的表达相关。

综上所述，XECG对脑缺血再灌注后损伤有保护作用，其机制可能与降低TNF-α、IL-1β 的表达，抑制炎症级联反应有关。

参考文献：

[1] 辛喜艳, 常静玲, 曹克刚,等.基于决策树分析探索缺血性中风早期各时段证候特征与近期预后的关系[J].中华中医药杂志, 2014,28(8): 2 647-2 650.

[2] 王国为, 夏洁楠, 侯江淇,等.浅析“五精所并”理论与中风证治[J].中华中医药杂志, 2014,28(8): 2 436-2 439.

[3] 马丽虹, 赵广, 李可建.缺血性中风血瘀生风病机假说的循证检验研究[J].山东中医药大学学报, 2014,37(2): 99-104.

[4] 应鑫. 消栓通络胶囊(每粒装0.54 g)治疗动脉粥样硬化性血栓性脑梗死的临床观察[D]. 长春: 长春中医药大学， 2008.

[5] 黄孝玲.消栓通络胶囊治疗缺血性中风21例[J].长春中医药大学学报, 2007，22(4): 45.

[6] 张冉, 戴瑛, 程新锐,等.消栓通络方有效成分组抗血栓作用及其机制研究[J].中成药, 2006，28(10): 1 479-1 481.

[7] 谢欣梅, 庞晓斌, 赵艳,等.消栓通络有效成分组对氧糖剥夺损伤原代培养神经元的保护作用[J].药学学报, 2014，61(8): 1 130-1 135.

[8] Yu K, Wu Y, Hu Y,et al.Neuroprotective effects of prior exposure to enriched environment on cerebral ischemia/reperfusion injury in rats: the possible molecular mechanism[J]. Brain Res, 2013, 1 538: 93-103.

[9] Xing H, Sun S, Mei Y,et al.The protective effect of rosuvastatin on ischemic brain injury and its mechanism[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2006, 26(6): 667-669.

[10] He W, Chen W, Zhou Y,et al.Xanthotoxol exerts neuroprotective effects via suppression of the inflammatory response in a rat model of focal cerebral ischemia[J]. Cell Mol Neurobiol, 2013, 33(5): 715-722.

[11] Bleilevens C, Roehl A B, Goetzenich A,et al. Effect of anesthesia and cerebral blood flow on neuronal injury in a rat middle cerebral artery occlusion (MCAO) model[J]. Exp Brain Res, 2013, 224(2): 155-164.

[12] Lin Y, Zhang J C, Fu J,et al. Hyperforin attenuates brain damage induced by transient middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rats via inhibition of TRPC6 channels degradation[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2013, 33(2): 253-262.

[13] Han Q, Liu S, Li Z,et al. DCPIB, a potent volume-regulated anion channel antagonist, attenuates microglia-mediated inflammatory response and neuronal injury following focal cerebral ischemia[J].Brain Res, 2014, 1 542: 176-185.

[14] Liu Y, Ning S L, Chen Y X,et al. Role of vascular cell adhesion molecule-1 in the mouse model of hepatic ischemia/reperfusion and the hematogenic metastasis [J]. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao, 2014, 36(4): 426-431.

[责任编辑段金卯]