刁依娜　蒋学华　邓璐霞　罗林

(1. 四川大学华西药学院，四川 成都 610041； 2. 四川科伦药业股份有限公司，四川 成都 610051；3. 四川大学华西医学中心口腔医院麻醉科，四川 成都 610041)



胡椒碱-阿霉素复合物合成及抗肿瘤研究*

刁依娜1,2蒋学华1邓璐霞2罗林3

(1. 四川大学华西药学院，四川 成都 610041； 2. 四川科伦药业股份有限公司，四川 成都 610051；3. 四川大学华西医学中心口腔医院麻醉科，四川 成都 610041)

【摘要】目的合成胡椒碱-阿霉素复合物，并探讨其抗肿瘤活性。方法将胡椒碱-阿霉素复合物制备成纳米混悬体冻干制剂，体外培养肿瘤细胞，用MTT法考察胡椒碱-阿霉素复合物纳米混悬液冻干制剂对HEPG-2细胞株、SMMC-7721/ADM细胞株、MCF-7/ADM细胞株、A549细胞株、B16细胞株、Hela细胞株、K562细胞株的抑制作用，并绘制抑制率-药物浓度曲线。结果对7种肿瘤细胞均有抑制作用，且抑制作用比阿霉素组更强。结论胡椒碱-阿霉素复合物对HEPG-2细胞株、SMMC-7721/ADM细胞株、MCF-7/ADM细胞株、A549细胞株、B16细胞株、Hela细胞株和K562细胞株生长有抑制作用，且抑制效果好于阿霉素。

【关键词】胡椒碱； 阿霉素； 肿瘤

阿霉素是蒽环类抗生素，从松链丝菌浅灰色变株中提取得到。60年代初被广泛用于肺癌、乳腺癌、恶性淋巴瘤、白血病等多种肿瘤的治疗。但蒽环类抗生素均有心脏毒性，其中以阿霉素较为严重，1973年Lefrak[1，2]等人首次报道了阿霉素的心脏毒性，相较于阿霉素的骨髓抑制、消化道不良反应和肾脏毒性，心脏毒性对人体的危害更为严重，从而限制了阿霉素的临床应用。其同类药物吡柔比星和表阿霉素，心脏毒性较阿霉素有所减轻，但仍无法完全避免。

胡椒碱是桂皮酞胺类生物碱，经过大量研究发现其在抗肿瘤、抗胃溃疡、降血脂、抗氧化、抗脑血管痉挛、促进黑素瘤细胞黑素的合成、保护心脏等多个领域均有不同程度的药理活性[2，3]。同时，在体外研究或动物研究中，还可将胡椒碱及其衍生物与多种药物联用，具有脊髓保护、抗抑郁、抗疲劳等药理作用[4~6]。本研究旨在制备胡椒碱-阿霉素复合物纳米混悬液冻干制剂(BPA)，并考察BPA在体外初步的抗肿瘤实验效果。

1材料与方法

1.1药品试剂、仪器与细胞株①药品试剂：RPIM 1640、DMEM细胞培养液；磷酸缓冲液；二甲基亚砜(DMSO)；MTT溶液；96孔培养板；戊二烯酸钠盐；阿霉素；胡椒酸酰胺化阿霉素。②仪器：EYELAFDU-1200真空冷冻干燥仪(日本EYELA公司)；生物倒置显微镜(重庆光电仪器有限公司XDS-1B)；CO2气瓶(北京华宇辰气体有限公司)；CO2减压器(上海三友仪器厂)；pH计(葡萄牙HANNApH211)；XYJ-802型离心沉淀机(江苏医疗仪器厂)。③细胞株与动物：HEPG-2：人肝癌上皮细胞株；SMMC-7721/ADM：人肝癌上皮细胞阿霉素耐药株；MCF-7/ADM：人乳腺癌上皮细胞阿霉素耐药株；A549：人肺腺癌上皮细胞株；B16：人黑色素瘤细胞株；Hela：人宫颈癌上皮细胞株；K562：人白血病细胞株。均购自ATCC细胞库。

1.2方法

1.2.1化合物的合成①(2E,4E)-5-(1,3-苯并二氧戊环-5-基)-2,4-戊二烯酸(BP)的合成：500ml三口瓶，磁力搅拌，回流冷凝，室温下加入胡椒碱1 5.7g(20mmol)(外购，含量：99%)，加入无水甲醇200ml，完全溶解后加入氢氧化钠1.7g (40mmol)(科龙化工，含量：96%)，然后升温至回流反应5h，TLC检测(展开剂：乙酸乙酯∶石油醚=1∶5)反应体系，原料1反应完毕后，冷却至室温后2N盐酸调节pH=2，冰浴下缓慢重结晶，过滤，干燥，得到产品为淡黄色粉末2 3.6g。HPLC检测含量99%，收率82%。HPLC-MS测定分子量M+218.3。②(2E,4E)-5-(1,3-苯并二氧戊环-5-基)-2,4-戊二烯酸阿霉素复合物(BPA)的合成：100ml三口瓶，磁力搅拌，回流冷凝，加入氯化钙干燥管，室温下加入BP 50mg(0.22mmol)，加入溶剂THF 10ml，完全溶解后加入羧基活化剂N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)30mg(0.24mmol)，完全溶解后冰浴冷却到0℃，滴入N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)50mg(0.24mmol)的DMF溶液5mL，该温度下反应1h，TLC检测(展开剂：甲醇∶乙酸乙酯=1∶2)反应体系，BP反应完毕后，滴加116mg(0.2mmol)盐酸阿霉素的DMF-三乙胺溶液6ml，滴加完毕后体系变为深血红色液体，然后控制温度室温反应12h，HPLC监控反应进程，反应完毕后减压蒸馏除去溶剂THF，得到深红色溶液，加入乙酸乙酯和适量水，萃取，水洗，乙酸乙酯用稀酸洗涤三次，无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗品。粗品进行柱层析纯化，洗脱剂：乙酸乙酯∶甲醇=2∶1，收集得到纯品，浓缩后得到深红色固体4 75mg。HPLC检测含量97%，收率48%。HPLC-MS测定分子量M+743.8。BPA的合成过程，见图1。

1.2.2BPA纳米混悬液冻干制剂的制备称取0.5g BPA，F6 80.2g，加入50ml蒸馏水中，高剪切混合乳化机分散1min，加入高压均质机中均质。均质条件：压力1000bar均质5次，压力2000bar均质20次。将均质后样品中加入适量冻干保护剂甘露醇，分装后于冷冻干燥机中冷冻干燥。最后灭菌即得成品。

1.2.3MTT实验方法收集对数期生长的细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μl。铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。5% CO2，37℃孵育12h，将细胞分为四组(空白对照组，ADM组，BP钠盐组，BPA)。BP钠盐组：(2E,4E)-5-(1,3-苯并二氧戊环-5-基)-2,4-戊二烯酸钠；BPA组：(2E,4E)-5-(1,3-苯并二氧戊环-5-基)-2,4-戊二烯酸阿霉素复合；ADM组：盐酸阿霉素。ADM组：加入浓度梯度(0.125、0.25、0.5、1.0和2.0μg/mL)的ADM；BP钠盐组：加入浓度梯度的ADM(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0μg/ml)，另外加入浓度梯度的BP钠盐(5μmol/L，15μmol/L，25μmol/L，50μmol/L)；BPA组：加入浓度梯度的BPA(0.125、0.25、0.5、1.0和2.0μg/ml)。设3个复孔。然后在5% CO2，37℃条件下孵育48h。每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5% MTT)，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD=490nm处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)。计算药物对细胞的抑制率：

图1胡椒碱-阿霉素复合物的合成过程

Figure 1The synthesis of piperine-doxorubicin complex

2实验结果

HEPG-2细胞株的MTT结果：BPA组与BP钠盐组50抑制率相当，且优于其他组(见图2)；SMMC-7721/ADM细胞株的MTT结果：BPA组的抑制率优于其他组(见图3)；MCF-7/ADM细胞株的MTT结果：BPA组与BP钠盐组50抑制率相当，且优于其他组(见图4)；A549细胞株的MTT结果，BP钠盐组50的抑制率略优于BPA组，但上述两组的抑制率均优于其他组(见图5)；B16细胞株的MTT结果：BPA组的抑制率优于其他组(见图6)；Hela细胞株的MTT结果：BP钠盐组50的抑制率优于其他组(见图7)；K562细胞株的MTT结果：BPA组与BP钠盐组50抑制率相当，且优于其他组(见图8)。

从各种细胞的抑制率比较结果，加入BP钠盐的各组抑制率与ADM组比较均有明显的提高，且BP钠盐的浓度达到50μmol/L的时候，抑制效果最为明显，BPA组的抑制效果较ADM组也有明显的提高，且抑制水平同BP钠盐浓度达到50μmol/L的时候，抑制效果相当。

图2 HEPG-2 MTT 检测结果

Figure 2MTT test results of HEPG-2

图3SMMC-7721/ADM MTT 检测结果

Figure 3　MTT test results of SMMC-7721/ADM

图5A549 MTT 检测结果

Figure 5　MTT test results of A549

图7Hela MTT 检测结果

Figure 7MTT test results of Hela

图8K562 MTT 检测结果

Figure 8MTT Test Results of K562

3讨论

阿霉素是临床上常用的一种抗肿瘤抗生素，抗瘤谱较广，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用，属周期非特异性药物。阿霉素可以抑制RNA和DNA合成，对RNA的抑制作用最强。胡椒碱是桂皮酞胺类生物碱，为胡椒的主要活性成分，存在于多种植物中，但在胡椒科植物中含量最高。目前有关胡椒碱的抗肿瘤药理研究有很多报道，已有文献报道将胡椒碱及其衍生物同多种药物联合用于抗抑郁、脊髓保护、抗疲劳等多个治疗领域[7~10]。

中药一直在临床治疗中占据着重要地位，在临床上越来越多的肿瘤患者在接受化疗的同时再服用中药，作为一种替代补充治疗的手段。据统计，肿瘤病人是服用中药最多的人群。有调查表明1990年全球约31.4%的肿瘤患者在接受放化疗同时使用中药，并且还有增加的趋势。但是中药也有其局限性，体外研究和临床观察表明中草药会和许多化学药物发生相互作用，而这种相互作用主要是由于中药中的活性成分会对人体内的各种药物代谢酶和/或转运体有影响。如果两者合用得当则可以发挥两者的优势，产生协同作用以提高药物疗效。但是如果合用不当，则会降低疗效甚至产生或增加毒副作用[7,8]。

本研究通过合成胡椒碱-阿霉素复合物，并将其制备成纳米混悬液冻干制剂，考察它对EPG-2细胞株、SMMC-7721/ADM细胞株、MCF-7/ADM细胞株、A549细胞株、B16细胞株、Hela细胞株和K562细胞株的抑制作用。结果显示胡椒碱-阿霉素复合物对上述7种细胞株的生长均有抑制活性，并且抑制活性高于盐酸阿霉素组。表明胡椒碱-阿霉素复合物可以提高阿霉素的疗效。这种将中药材的主要活性物质通过化学合成方法与化学药制成复合物，为中西药合用提供了一种新的研究思路，但是其作用机制、安全性等目前尚未明确，有待进一步的研究深入探讨。

4结论

本研究提示，将胡椒碱与阿霉素联合使用与阿霉素单用相比提高了抗肿瘤活性，胡椒碱-阿霉素复合物对研究中所选肿瘤细胞株的生长均表现出抑制作用，为胡椒碱与其他药物联用提供了初步的证据，也为中西药合用提供了新的研究思路。

【参考文献】

[1]Lefrak E A, Piha J, Rosenheim S,etal. A clinicopathologic analysis of adriamycincardiotoxicity[J]. Cancer, 1973, 32(2): 302-314.

[2]Steinherz LJ, Steinherz P, Tan CTC,etal. Cardiac toxicity 4 to20 years after completing anthracycline therapy[J]. JAMA,1991, 266(12):1672-1677.

[3]麻春杰.胡椒碱及其衍生物的药理作用研究进展[J]. 中国中医药科技，2007，16(5)：381-382.

[4]曾龙辉，徐丽慧，何贤辉，等. 胡椒碱与棉酚联用对前列腺癌DU145细胞生长抑制的协同作用[J]. 中国药理学通报，2012，28(8)：1101-1105.

[5]王钱东，朱洁瑾，张璐，等. 漆黄素与胡椒碱联合应用的抗抑郁作用及机制研究[C]. 2011年中国药学大会暨第11届中国药师周论文集，2011.

[6]杨柳，熊友生. 奥伐尼和胡椒碱对成熟鼠脊髓胶状质神经元自发兴奋性突触传递的研究[C]. 江西省第五次中西医结合神经科学术交流会论文集，2011.

[7]崔广智，金树梅. 胡椒碱抗抑郁作用研究[J]. 辽宁中医药大学学报，2010，12(7)：42-43.

[8]刘红，赵建平，谭乐和. 胡椒碱的研究进展[J]. 中国调味品，2008，10：33-36.

[9]廖红波，刘屏，胡园. 胡椒碱的抗抑郁及神经保护作用研究[J]. 中国中药杂志，2009，34(12)：1562-1565.

[10] 李宁，于力方，王珊. 阿霉素纳米粒在肿瘤治疗中的应用研究[J]. 现代生物医学进展，2012，12(30)：5836-5837，5867.

Study on the synthesis of piperine-doxorubicin complex and its anti-tumor activities

DIAO Yi-na1,2, JIANG Xue-hua1, DENG Lu-xia2,etal

(1.WestChinaSchoolofPharmacy,SichuanUniversity,Chengdu610041,China;2.SichuanKelunPharmaceuticalCo.Ltd.,Chengdu610051,China)

【Abstract】ObjectiveTo research the anti-tumor activity of synthetize piperine and doxorubicin. Methods HEPG-2 cell strain, SMMC-7721/ADM cell strain, MCF-7/ADM cell strain, A549 cell strain, B16 cell strain, Hela cell strain and K562 cell strain were cultured in vitro. The inhibitory action of lyophilized preparation of piperine-doxorubicin complex on tumor was evaluated with MTT. The inhibition ratio-drug concentration curve was made.ResultsPiperine-doxorubicin complex had inhibitory action to the 7 tumor cells and the inhibiting effect was better than doxorubicin. ConclusionPiperine-doxorubicin complex has inhibitory action to HEPG-2 cell strain, SMMC-7721/ADM cell strain, MCF-7/ADM cell strain, A549 cell strain, B16 cell strain, Hela cell strain and K562 cell strain, and the inhibiting effect is better than doxorubicin.

【Key words】Piperine; Doxorubicin; Tumor

(收稿日期：2014-08-01； 编辑： 陈舟贵)

通讯作者：蒋学华，E-mail:jxh1013@scu.edu.com

基金项目：国家自然科学基金(30972764/H1005)

【中图分类号】R 979.1

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.01.040