李应宏　莫烨　李劲梅　阙玉梅　张玲

(1.攀枝花市攀钢集团总医院，四川 攀枝花 617023；2.四川大学华西医院神经内科, 四川 成都 610041)



耐药性癫痫患者脑内Nurr1基因及蛋白产物的表达*

李应宏1莫烨1李劲梅2阙玉梅1张玲1

(1.攀枝花市攀钢集团总医院，四川 攀枝花 617023；2.四川大学华西医院神经内科, 四川 成都 610041)

【摘要】目的研究耐药性癫痫患者颞叶和海马组织中Nurr1基因及其蛋白产物的表达,探讨其在耐药性癫痫形成中的作用。方法用RT-PCR和免疫组化联合检测40例耐药性癫痫患者(实验组)脑组织中Nurr1基因及蛋白产物的表达，并与11例对照组比较。结果RT-PCR结果显示Nurr1 mRNA水平在耐药性癫痫患者脑组织中表达较对照组增高，Nurr1/ GAPDH(内参基因)灰度值在耐药性癫痫患者脑组织中为6.18，对照组为2.39(P<0.05)。免疫组化与RT-PCR结果一致，显示耐药性癫痫颞叶和海马Nurr1蛋白表达水平高于对照组 (P<0.05)。结论Nurr1基因及其蛋白产物在耐药性癫痫患者脑内表达明显增加,提示其可能参与了耐药性癫痫的发生与发展。

【关键词】Nurr1基因; 苔藓纤维; 难治性癫痫

神经元网络重组和兴奋性突触环路形成是耐药性癫痫最为重要的病理特征，而苔藓纤维发芽则是其形成的病理基础，研究与异常芽生的相关因素,进而寻求其改进的方法有可能为耐药性癫痫的治疗开辟新的途径。为此,我们利用荧光定量PCR(Fluorescence quantitation real time polymerase chain reaction,FQ-rtPCR),免疫组化和免疫荧光法研究了与苔藓纤维芽生密切相关的Nurr1基因在耐药性癫痫患者颞叶中的表达，现报告如下。

1资料和方法

1.1临床资料实验组40例耐药性癫痫病人系2011年12月~2013年12月在华西医院神经外科行手术治疗者。所有病人均符合以下条件：①有癫痫发作的典型表现和脑电图特征，正规服用二种或二种以上一线抗癫痫药(卡马西平、丙戊酸、苯妥英钠)治疗2年以上，血药浓度在正常高限，与发作前基线比较，发作频率没有明显减少。②无明显病因可寻，神经系统体格检查没有局灶性神经系统体征或虽有体征但与癫痫发作无关，术后脑组织检查没有发现能引起癫痫发作的病因。③病人的发作类型符合国际抗癫痫联盟1981年有关癫痫发作类型分类的规定。④头部CT或核磁共振检查除海马硬化外，未发现占位性病变或其他能解释癫痫发作的疾病。⑤术前均经24h脑电图或视频脑电图(Vedio electrocorticography VEEG)或术前1周放置硬膜下电极，并结合CT或MRI定位致痫灶。⑥术中均用皮质电极(ECoG)监测，术后在切除的边缘再次放置ECoG确保致痫灶完整切除。⑦病人及其家属术前均签知情同意书。40例难治性癫痫临床资料见表1。对照组11例系成都市因意外死亡或非自然死亡后按法律规定需进行尸解的人，符合下列条件: ①无中枢神经系统疾病病史。②病理切片证实脑组织结构基本正常。③取材部位为海马和颞叶，死亡时间与取材时间<6小时。④家属同意,并签注知情同意书。对照组11例临床特征见表2。

表1　实验组40例难治性癫痫患者的临床特征

注：CPS：复杂部分性发作(Complex Partial Seizure); SGS：部分性发作继发全身性发作(Secondarily Generalized Seizure); TS：强直性发作(Tonic Seizure); MT：多种类型发作(Multiple Type) 强直-阵挛性、强直性、阵挛性，复杂部分性、单纯部分发作; TN：颞叶皮质(Temporal Neocortex); H：海马(hippocampi); L：左侧(left); R：右侧(right); nl：神经元丢失(neurons loss); g：胶质细胞增生(gliosis); nd：神经元变性 (neurons degeneration); ac：星型胶质细胞增生(astrocytosis); a：萎缩(atrophy); nad：无异常发现(no abnormal finding)

表2　对照组11例患者临床特征

注：TN：颞叶皮质(Temporal Neocortex); H：海马(hippocampi); L：左侧(left); R：右侧(right)

1.2实验方法术中获取实验组标本，标本取出后，立即用已编号并浸泡于DEPC液24小时以上的锡纸包裹后置于液氮中冷冻保存，部分置于4%多聚甲醛固定48小时后常规石蜡包埋，备用。对照组处理方法同上。

1.2.1伊红染色和芽生标记物GAP43的检测实验组和对照组石腊标本行连续冠状切片，片厚4μm，行常规的伊红染色，光镜下观察病理改变。用免疫荧光法检测实验组中芽生标记物GAP43，具体操作步骤如后所述，一抗滴度1∶100(Rabbit against human, Santa Cruz,USA),二抗滴度1:200(Fitc标记山羊抗兔，北京中杉生物公司)

1.2.2总mRNA的提取RNA制备及质检:细胞总mRNA采用UNIzol 试剂(Boistar公司)，按操作说明书抽提，提取的总RNA样本保存在加入了RNase-free的Mikki-Q水完全溶解RNA沉淀后，-80℃冰箱保存。用紫外分光光度仪、电泳、水浴试验进行质检，合格后采用mRNA柱纯化试剂盒(Boistar公司)纯化个体样品的 mRNA，逆转录生成cDNA。

1.2.3RT-PCR对质检合格的样品mRNA经紫外分光光度计测定A260/A280值，合格后，分别取5μg mRNA为逆转录模板。根据rt-PCR引物设计原则，Primer express1.5软件设计前导链5′-GCACTTCGGCAGAGTTGAAT-3′，后随链为5′-TGGACAGTGTCGTAATTCAA-3′，GAPDH为内参基因。反应体系置于Corbet Research公司的Rotor Gene 3,000 PCR仪进行PCR反应。样品按下列条件扩增：94℃ 2 min预变性，然后94℃ 30 sec，61℃ 30 sec，72℃ 30 sec共40个循环, 72℃延伸10min。PCR反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳观察。经凝胶图像分析系统，对RT-PCR产物的电泳条带进行灰度值分析。

1.2.4免疫组织化学染色免疫组织化学染色采用ABC法，按试剂盒说明书操作，加入兔抗人抗体Nurr1(SATA CRUZ公司)，滴度1∶100，4 ℃过夜，加入生物素标记的二抗，DAB显色(北京中杉生物公司)，苏木素复染，分色，梯度酒精脱水，常规封片。采用YC-FY-2050型病理采集系统分别对实验组和对照组切片行图像采集，每张切片随机选4个视野，北航CM-2000B型生物医学图像分析系统检测光密度值。

1.3统计学分析采用SPSS 11.0 统计软件对数据进行单因素方差分析(One Way ANOV)，用均数±标准差表示，两组数据比较时若方差齐用t检验，方差不齐用t′检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1常规病理检查和芽生标记物GAP43标记HE染色常规病理检查显示癫痫患者颞叶脑组织中有不同程度的神经元丢失、变性，胶质细胞增生和轴突断裂(见图1)。实验组颞叶皮质和海马均可见芽生标记物GAP43的阳性着色，而对照组未见GAP43阳性表达(见图2)。

2.2RT-PCR结果RT-PCR结果显示，正常脑组织中Nurr1mRNA灰度值/ GAPDH灰度值的比值为2.39，耐药性癫痫脑组织灰度值/ GAPDH灰度值的比值为6.18 (见图3)。

Table 3Comparison of Nurr1 optical density between the experimental group and the control group

海马区域实验组对照组tP锥体细胞层0.2038±0.04020.035±0.03627.850.0000CA1区0.1702±0.03030.0117±0.021511.930.0000CA3区0.195±0.03670.015±0.018710.690.0000齿状回区0.2083±0.04580.0117±0.007510.380.0000

图1HE染色结果

Figure 1HE stain of RE group and control group

注：a：HE染色的耐药性癫痫组海马;b：HE染色的对照组海马；图中a、b标尺均为100μm.光镜下观察可见耐药性癫痫组神经元较对照组神经元排列结构紊乱.部分神经元变性、坏死

图2芽生标记物GAP43的检测

Figure 2GAP43 immunolabelling

注：难治性癫痫组颞叶和海马神经细胞体和轴突均可见GAP43阳性标记的神经细胞。对照组则未见GAP43阳性着色细胞。a：癫痫组颞叶皮质；b：癫痫组海马；c：对照组颞叶皮质；d：对照组海马；a、c标尺75 μm；b、d标尺37.5 μm

图3Nurr1基因的rt-PCR电泳图

Figure 3rt-PCR result of Nurr1

注：C：为对照组；RE：为耐药性癫痫组；内参设置为GADPH，耐药性癫痫组Nurr1的mRNA扩增条带明显宽于对照组

图4免疫组化结果

Figure 4Immunohistochemistry results

注：结果显示Nurr1蛋白质在耐药性癫痫颞叶和海马中较对照组均明显升高。a：耐药性癫痫颞叶皮质神经元；b：对照组颞叶皮质神经元；c：颞叶胶质细胞；d：对照组胶质细胞；e：耐药性癫痫海马锥体细胞；f：对照组海马锥体细胞；g：耐药性癫痫海马CA3区颗粒细胞；h：对照组海马CA3区颗粒细胞；i：大鼠中脑神经元阳性对照；j：阴性对照

3讨论

约70%的癫痫患者经正规药物治疗后能有效控制发作，但仍有30%左右的患者对传统的一线抗癫痫药耐药，称为耐药性癫痫。耐药性癫痫治疗困难的原因很多，但最重要的是对其发病机制不了解,无法根据发病的中心环节来开发新的药物,寻求新的治疗途径。研究耐药性癫痫形成的相关因素,有可能为改善目前治疗上的被动局面提供新的思路。神经元网络重组和兴奋性突触环路形成是耐药性癫痫主要的病理特征，而苔藓纤维芽生则在其中起着重要作用。研究芽生的相关因素有可能为揭示耐药性癫痫发生发展提供重要线索。

Nurr1基因属于核受体超家族的孤儿受体。1992年由Law[1]首次在鼠脑内克隆出。该基因位于2q22-23，具有独特的锌指结构蛋白，可与DNA以单体或异二聚体联结以调节基因的转录[2-3]。分布于黑质和中脑腹侧被盖区的Nurr1与脑内多巴胺(Dopamine, DA)神经递质密切相关，对DA能神经元的发育、生存和功能的维持起着重要的作用[4],而海马和脑皮质中的Nurr1功能则与DA无关[5]。海马中Nurr1 mRNA在脑发育初期高水平表达，脑发育成熟后水平明显下降[1]。

异常芽生引起颞叶，尤其是海马通路的结构和兴奋性改变已在癫痫动物模型中得到证实[6]，尽管这种改变的分子机制至今尚不清楚，但即早基因可能在其中起着重要作用，敲除此基因的小鼠点燃后没有明显芽生存在[7]，而此基因的突变鼠除有癫痫发作外，还有明显的苔藓纤维芽生[8]。即早基因诱发苔藓纤维芽生可能与它们编码的转录因子可诱导依赖神经元活动的基因级联瀑布反应有关, 在激活一系列后效应基因(late-effector genes)的转录后，激活酶，神经肽，受体，离子通道，结构蛋白，生长因子等基因都明显表达上调，从而引起持续性生化效益，导致神经元突触重塑，即早基因引起的这种神经元突触重塑与癫痫灶的形成发展密切相关[9]。Nurr1作为唯一的由即早基因编码的核受体蛋白，在细胞信号传递中起着核心作用[10]。

本文在检测到芽生标记物GAP43的耐药性癫痫组中发现，Nurr1在颞叶皮质和海马中的表达较对照组明显上调，提示Nurr1参与了耐药性癫痫的形成。作为芽生早期“分子开关”，Nurr1的持续表达上调有可能是癫痫芽生的早期标记物，改变其表达,有可能成为新药开发的一个新靶点。

Nurr1表达还受神经细胞膜去极化或痫性发作的影响，动物实验发现，海人藻酸诱导的癫痫模型中Nurr1可在海马的CA1，CA3和颞叶皮质中持续升高[11]。Nurr1直接或与其它即早基因相互作用共同调节神经活动依赖性基因如生长因子及其受体，突触和轴突蛋白等效应基因的转录在突触重塑方面发挥作用[5]。Nurr1还可影响突触前膜囊泡代谢基因KA2的转录，后者是谷氨酸受体亚单位，与突触间神经递质传递和神经分化有关[12]。最近的研究已发现突触功能异常可能在耐药性癫痫的形成中起着重要作用[13]。Nurr1和其它即早基因一样，受癫痫活动的调节并使其电活动持续升高，导致局部神经元的持续性兴奋和长时程电位的强化[14]。而突触的长时程电位持续10天即可诱发明显的芽生[15],导致突触功能和结构改变,进行促进顽固性痫灶形成。

4结论

本研究结果显示，Nurr1基因及其蛋白产物在耐药性癫痫患者脑内表达明显增加,提示其可能参与了耐药性癫痫的发生与发展。

【参考文献】

[1]Law SW, Conneely OM, DeMayo FJ,etal. Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1[J]. Mol Endocrinol, 1992,6(12):2129-2135.

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The study of mRNA and protein level expression of Nurr1 in refractory epilepsy

LI Ying-hong，MO Ye， LI Jin-mei，etal

(GeneralHospitalofPangangGroup,Panzhihua617023,Sichuan,China)

【Abstract】ObjectiveTo learn Nurr1 mRNA and protein expressional levels in temporal lobe and hippocampus tissue of patients with refractory epilepsy and the role it plays in mossy sprouting. MethodsFQ- rtPCR, and immunohistochemistry were used to check Nurr1 mRNA and protein levels in refractory epilepsy, comparing to the 11 cases from control group. ResultsRt-PCR result showed Nurr1 mRNA level was up regulated in refractory epilepsy group. The gray scale ratio of Nurr1 and GADPH is 6.18 in refractory epilepsy and 2.39 in the control group (P<0.05). Immunohistochemistry showed the protein level of Nurr1 up-regulated obviously in refractory in epileptic temporal lobe, the optical density value is 0.2417±0.0426 in refractory epilepsy and 0.065±0.0524 in the control group(P<0.05), the similar result also got in hippocampus tissue. ConclusionThe function of Nurr1 is associated with mossy fiber sprouting closely, both Nurr1 mRNA and protein level up regulated in refractory epilepsy indicated it play an important role in mossy fiber sprouting process.

【Key words】Nurr1; Mossy fibers; AEDs resistant epilepsy

(收稿日期：2014-02-17； 编辑： 陈舟贵)

通讯作者：李劲梅，E-mail: jinmeili-neuro@qq.com

基金项目：国家自然科学基金(81071047)

【中图分类号】R 742.1

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.01.002