孔德平，陈 凯

（重庆医科大学附属永川医院药剂科 402160）

增生性瘢痕是各种烧、创伤后最常见的并发症，易导致患者伤处外观畸形及功能障碍。其形成是由于皮肤创伤后的愈合过程中，成纤维细胞过量增殖和胶原纤维过度增生的结果。通过传统压力治疗、硅酮凝胶外用、曲安奈德局部注射治疗均疗效不确切，并可能因治疗导致一系列并发症[1]。5-氟尿嘧啶（5-FU）是一类广谱的氟化嘧啶类抗肿瘤药物，可以通过细胞内抑制DNA的合成，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。近年来发现该药在瘢痕治疗方面具有一定作用[2-3]，但具体机制尚不清楚。本实验旨在通过建立兔耳增生性瘢痕模型，探讨5-FU对兔耳创面瘢痕形成的影响及其作用机制，为瘢痕防治及药物临床应用提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 兔耳增生性瘢痕模型的建立

1.1.1 实验动物及分组 选择12只健康新西兰大耳白兔，雌雄不限，体质量1.5～2.5kg，月龄8～10个月。随机分为3组，生理盐水注射对照组（A组），5-FU 1.0mL＋生理盐水4.0 mL，5-FU浓度5.0mg／mL局部注射组（B组），5-FU软膏局部外用组（C组），使用2.5%5-FU软膏，广州白云山何济公制药有限公司生产，批准文号：国药准字H44023085。

1.1.2 兔耳增生性瘢痕模型的制作 瘢痕模型的制作参照冯登超[4]方法建立兔耳增生性瘢痕模型。于术后60d空气栓塞法随机处死兔子，分别沿创面边缘0.5cm处环形切开，切取含创面的兔耳组织，取材后的兔子即退出实验。所取组织均匀4等分。

1.2 苏木精-伊红（HE）染色和Masson三色染色 10%的中性甲醛固定、脱水、包埋、切片、HE染色后进行组织学观察，检测组织中细胞及胶原等的改变。Masson三色染色法参照参考文献[5]。

1.3 ELISA定量检测 术后60d抽取静脉血，按转化生长因子β（TGF-β）、血小板源生长因子（PDGF）、碱性成纤维细胞因子（bFGF）、INF-γ和的ELISA试剂盒说明书分别操作，每例样本组设3个平行复孔。根据检测吸光度值用Curve Expert软件分析并制定标准曲线，从而计算出不同条件培养基中各因子的浓度。

1.4 实时荧光定量PCR（Real-time PCR） 按Trizol操作说明书提取细胞总RNA并逆转录扩增cDNA，使用反应Real time PCR仪检测TGF-β、PDGF、bFGF和INF-γ。检测条件：预变性95℃，15min；变性95℃，10s，退火／延伸60℃，30s，40个循环。采用Real-time PCR仪自带分析软件分析各样品各基因表达情况。相对定量采用2-ΔΔCT法计算。引物序列见表1。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计数资料组间比较采用χ2检验，计量资料组间比较行t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 瘢痕形成情况 通过肉眼观察，A组表现为斑块质硬，色红。B、C组瘢痕质地柔软平整；且B组比C组瘢痕明显软化、变平。

2.2 组织切片观察 HE染色切片结果表明，A组（图1A）其瘢痕厚，胶原纤维多而致密粗大，排列紊乱，可见漩涡状结构和胶原结节，其间有少量炎性细胞，结构近似人的增生性瘢痕组织。B组（图1B）瘢痕厚度显著降低，核较小，胶原纤维束间有较大的空隙，排列比较规则，呈水平方向。C组（图1C）瘢痕厚度较薄，成纤维细胞数量较少，胶原纤维致密下降，表层排列规则，内层排列方向似漩涡状。Masson染色切片结果表明：胶原纤维呈蓝色，于细胞间散在分布。与A组（图1D）相比，B组（图1E）及C组（图1F）胶原纤维染色较淡，较为疏松，且二者间有明显区别。

图1 3组染色组织切片影像学表现

图2 Real-time PCR和ELISA检测TGF-β、PDGF、INF-γ、bFGF的表达水平

2.3 INF-γ、PDGF、bFGF和TGF-β的表达水平 通过Real-time PCR检测，A组、B组与C组中，TGF-β、PDGF、bFGF、INF-γ的mRNA表达均有明显下降；且B组mRNA下降幅度更大。接着采用ELISA方法对4种细胞因子的蛋白做了进一步检测，结果与Real-time PCR检测一致（图2）。

表1 Real-time PCR引物序列

3 讨论

增生性瘢痕是皮肤创面愈合后瘢痕持续增生的一种病理现象，其本质是以成纤维细胞为主的细胞成分过度增殖，合成并分泌胶原为主的细胞外基质。瘢痕组织中胶原纤维大量沉积，排列紊乱，主要以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主。胶原的过度分泌和降解减少是胶原沉积的主要原因[6]。由于增生性瘢痕的发生机制目前仍未阐明，至今还缺乏具有临床指导意义的防治方法。

近年来的研究发现5-FU除了具有抗肿瘤作用，国内外均有5-FU应用于抗瘢痕的报道。瘢痕疙瘩切除后局部单纯应用5-FU能够改变瘢痕疙瘩创面的愈合特征，合理的用药剂量及时间尚需进一步研究[7]。国内研究发现5-FU在体外能明显抑制人增生性瘢痕组织中成纤维细胞的增殖及cyclinD1、cdk4的mRNA表达[8]。研究者采用低浓度去炎松-A（5～10 mg／mL）和5-FU（6.25mg／mL）混合液治疗病理性瘢痕，也获得了满意的疗效[9]。本研究中，通过HE及Masson实验发现，与A组和C组比较，B组显著改善了瘢痕组织的病理状况。

TGF-β是促进瘢痕增生的主要刺激因子[10]。研究发现TGF-β可刺激成纤维细胞分泌纤维连接蛋白，Ⅰ、Ⅲ型胶原和前胶原。还可减少胶原酶降解细胞外基质的作用，并间接地通过PDGF刺激细胞外基质的产生，促进瘢痕增生。其他如PDGF、bFGF等均在增生性瘢痕组织中表达增高[11-13]。他们可通过各种途径促进成纤维细胞增殖和胶原纤维分泌[14]。基于以上机理，为了研究5-FU抑制增生性瘢痕作用机制，作者通过Real-time PCR及ELISA实验发现B、C组明显的抑制INF-γ、PDGF、bFGF、TGF-β的mRNA及蛋白的表达，且B组效果优于C组。

本研究利用外伤性兔耳早期瘢痕增生模型，证实了5-FU通过抑制INF-γ、PDGF、bFGF、TGF-β的表达抑制兔皮肤增殖性瘢痕，且局部注射比软膏外用抑制瘢痕增生效果更显著。进一步研究其作用机制、给药方式，以及对5-FU进行化学修饰合成，降低其不良反应，有望开发出预防和治疗人皮肤增生性瘢痕的有效药物。

[1] Zeng G，Zhong F，Li J，et al.Resveratrol-mediated reduction of collagen by inhibiting proliferation and producing apoptosis in human hypertrophic scar fibroblasts[J].Biosci Biotechnol Biochem，2013，77（12）：2389-2396.

[2] Ogawa R.The most current algorithms for the treatment and prevention of hypertrophic scars and keloids[J].Plastic Reconstruct Surg，2010，125（2）：557-568.

[3] 武晓莉.手术联合低浓度5-氟尿嘧啶和糖皮质激素局部注射治疗耳郭瘢痕疙瘩疗效观察[J].中华医学杂志，2009，16（89）：1102-1105.

[4] 冯登超.青蒿素对免耳创面瘢痕增生的抑制效应[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，24（12）：4601-4605.

[5] 林云恩，龙惠东，许惠娟，等.微波改良Masson三色法在观察博来霉素诱导的大鼠肺纤维化中应用[J].临床与实验病理学杂志，2011，26（9）：1014-1016.

[6] 汤苏成.喉、气管狭窄瘢痕的基础研究现状[J].山东大学耳鼻喉眼学报，2008，6（22）：568-571.

[7] 姜疆，刘毅.瘢痕的药物治疗现状[J].临床军医杂志，2008，36（1）：121-125.

[8] 陈天新.5-FU对增生性瘢痕中cyclinD1、cdk4及p53基因表达的影响[J].中国美容整形外科杂志，2006，5（17）：343-346.

[9] 崔子伟.低浓度去炎松-A和5-氟脲嘧啶混合液治疗增生性瘢痕[J].中华医学美学美容杂志，2008，6（14）：1532-1533.

[10] Penn JW，Grobbelaar AO，Rolfe KJ.The role of the TGF-βfamily in wound healing，burns and scarring：a review[J].Int J Burns Trauma，2012，2（1）：18-28.

[11] Zhang XF，Guo SZ，Lu KH，et al.Different roles of PKC and PKA in effect of interferon-gamma on proliferation and collagen synthesis of fibroblasts[J].Acta Pharmacologica Sinica，2004，25（10）：1320-1326.

[12] Akimoto S，Ishikawa O，Iijima C，et al.Expression of basic fibroblast growth factor and its receptor by fibroblast，macrophages and mast cells in hypertrophic scar[J].Eur J Dermatol，1999，9（5）：357-362.

[13] Ren HT，Hu H，Li Y，et al.Endostatin inhibits hypertrophic scarring in a rabbit ear model[J].J Zhejiang Univ Sci B，2013，14（3）：224-230.

[14] 张玲，武继祥，李世荣.肥厚性瘢痕和瘢痕瘤的病因病理学研究进展[J].局解手术学杂志，2005，14（2）：127-128.