乔正荣，付志豪，冯虎翼，李元君，龚建平，李生伟

（重庆市第五人民医院普外科 400062）

肝癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，手术切除一直是首要的治疗手段。但由于肝癌的早期症状与体征不明确，致使大多患者在确诊时就已错过最佳手术治疗时机。单一的局部治疗手段对晚期肝癌患者的治疗效果不佳，所以，多种方法的综合治疗为中晚期肝癌的治疗提供新的思路。射频消融（RFA）、经动脉化疗栓塞（TACE）和高频热疗（HFH）是目前常用的局部治疗方式，而且他们之间的综合治疗的效果明显优于单一治疗方式的治疗效果[1-2]，但具体的机制尚不明确。因此，本研究建立兔VX2肝移植瘤模型，检测三者之间联合治疗后癌组织中细胞凋亡和Caspase-3的表达情况，并初步探讨联合治疗后对肿瘤细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 清洁级，新西兰大白兔40只，体质量1.5～2.0kg，购于重庆医科大学动物实验中心，合格证号：SCXK（渝）2012-0001，雌雄不限，隔笼喂养。

1.2 主要试剂及仪器 TUNEL试剂盒（Roche公司），兔抗兔Caspase-3抗体（博士德公司），免疫组织化学试剂盒（中杉金桥公司），RT reagent Kit（Takara公司），RNA抽提试剂盒（Omega公司），逆转录试剂盒（Takara公司），HCGF-3000型冷循环射频治疗仪及单极射频针（和佳公司），HCGF-2000型体外高频治疗仪（和佳公司）。

1.3 方法

1.3.1 动物模型的建立、分组及治疗方式 建立肿瘤模型全部成功。随机分为RFA＋TACE治疗组（A组）、RFA＋TACE＋HFH治疗组（B组）、RFA＋HFH治疗组（C组）和TACE＋HFH治疗组（D组），每组10只。治疗方式：C组：麻醉后开腹，在肿瘤中央插入单极射频消融针，功率为10W，治疗区域颜色发黑后停止治疗。RFA治疗后第1、4、7天分别给予HFH治疗仪治疗，治疗频率为13.56MHz，持续15min。B组：麻醉后开腹，暴露肝动脉及其分支，暂时给予阻断肝动脉分支，用皮针直接在肝固有动脉缓慢注入碘化油乳剂0.2 mL／kg，注完后开放肝动脉，可在肿瘤表面观察到乳白色碘油沉积。再行RFA治疗。RFA治疗后第1、4、7天分别给予HFH治疗仪治疗。A组：先行TACE治疗，再行RFA治疗。D组：先行TACE治疗，治疗后第1、4、7天分别给予HFH治疗仪治疗。于第7天处死全部实验兔，切取肿瘤中心组织、边缘组织作为检测标本收集。

1.3.2 缺口末端核苷标记法（TUNEL）检测细胞凋亡及计算凋亡指数 取出各组标本，具体步骤按TUNEL试剂盒说明书进行。阳性判断标准：显微镜下肿瘤细胞核显示棕黄色颗粒为阳性，每组随机取5个高倍视野（×400），计算细胞凋亡指数（AI）＝阳性细胞数／肿瘤细胞数×100%。

1.3.3 免疫组织化学法检测各组肿瘤组织Caspase-3蛋白变化 取出各组标本，采用免疫组织化学SP法。具体步骤按照免疫组织化学试剂盒说明书进行。阳性标准：在显微镜下，细胞质出现棕黄色为阳性。

1.3.4 Western blot检测各组肿瘤组织中的Caspase-3蛋白含量 取出各组标本，提取组织蛋白、制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳、转膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗、洗涤等过程，然后显影，分析结果。

1.3.5 实时荧光定量PCR法检测各组Caspase-3mRNA的表达水平 将组织磨碎，提取无RNase的水溶解RNA，RNA定量。逆转录参照试剂盒，实时荧光定量聚合酶链反应扩增条件为95℃预变性2min；随后95℃10s，退火温度15s，72℃延伸45s，共40个循环；最后72℃延伸10min。上游引物：5′-CAA TGG ACT CTG GGA AAT-3′，下游引物：5′-GCA AGC CTG AAT AAT GA-3′。采用△△CT法进行实时荧光定量PCR相对定量反应，计算相对含量。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，数据用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清谷丙转氨酶的情况 治疗后各组血清谷丙转氨酶明显升高，A组为（148.7±8.682）U／L、B组为（170.5±7.084）U／L、C组为（67.55±4.159）U／L、D组为（132.1±4.485）U／L。与其他组比较，B组治疗后血清谷丙转氨酶显著升高（P＜0.05），见图1。

图1 治疗后各组血清谷丙转氨酶的变化情况

2.2 在光学显微镜下TUNEL检测残余肿瘤的凋亡结果 在各组观察的细胞凋亡，可见细胞核呈棕黄色颗粒的凋亡细胞，见图2。各组细胞凋亡指数：A组为（17.09±1.310）%，B组为（25.11±1.998）%，C组为（9.684±1.020）%，D组为（5.780±0.583）%，B组凋亡指数显著升高（P＜0.05），见图3。

图2 各组肿瘤组织细胞的凋亡变化（×400）

图3 各组细胞凋亡指数情况

2.3 免疫组织化学检测Caspase-3蛋白在各组表达情况 在显微镜下，Caspase-3蛋白的表达定位于细胞质，出现棕黄色颗粒。与其他组比较，B组肿瘤胞质染色深，而且数量也多，见图4。

2.4 Western blot检测Caspase-3蛋白在各组表达情况 Caspase-3蛋白在各组的相对表达量：A组为0.860 3±0.048 71，B组为1.293±0.006 590，C组为0.549 5±0.037 40，D组为0.340 6±0.019 90，其中，B组表达最高，与其他组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。

2.5 实时荧光定量PCR技术检测Caspase-3mRNA水平 Caspase-3mRNA在各组的相对表达量：A组为4.242±0.181 4，B组为7.943±0.746 9，C组为1.744±0.145 4，D组为1.021±0.263 2。其中，B组表达最高，与其他组比较差异 有统计学意义（P＜0.05），见图6。

图4 免疫组织化学法检测Caspase-3蛋白在各组表达情况（×400）

图5 Caspase-3蛋白在各组肿瘤组织中的表达情况

图6 Caspase-3mRNA在各组中的表达情况

3 讨论

RFA、TACE、HFH是安全易行的局部治疗方法，且应用十分广泛。局部治疗已成为延长晚期肝癌患者生存的最为有效方法，但由于单一的治疗方式存在局限性，对晚期的肝癌治疗效果不佳，因此，多种局部治疗方式联合应用的综合治疗为晚期肝癌患者提供了新的思路。前期的研究证实了RFA、TACE、HFH联合的综合治疗能更有效地杀灭肿瘤细胞和使肿瘤组织局限化，降低肿瘤的侵袭力，有效地激活HSP70和树突状细胞，增加机体抗肿瘤细胞免疫力[3-5]，改善预后，但是，缺乏对肿瘤持续杀伤作用的研究。Rai等[6]研究证实了RFA在治疗后能够产生持续一段时间的凋亡作用，并促进HSP70蛋白的表达，增强机体对肿瘤细胞的免疫力。Gao等[7]对兔肝VX2肿瘤实验表明TACE在促进肿瘤细胞凋亡方面也存在一定的作用，与药物联合应用后促凋亡作用明显增强。

细胞凋亡是细胞对内环境改变出现的一种生理变化，主要存在激活Fas的外源性信号通路和依赖Bcl蛋白家族的线粒体相关的内源性信号通路，但最终细胞凋亡环节是Caspase家族，其中最重要的是Caspase-3蛋白，是细胞凋亡的最终执行者之一。Takahashi等[8]研究表明热损伤效应可以通过破坏DNA双链的稳定性从而导致细胞的凋亡。Weinmann等[9]研究表明缺氧可以通过FADD／Caspase-8蛋白最终引起Caspase-3蛋白表达增多，促进缺氧的细胞凋亡。RFA通过局部电流频率达到一定值后引起组织内带电荷的离子运动产生热效应从而杀伤肿瘤细胞。TACE则是选择性阻断肿瘤的供血血管，使肿瘤细胞严重缺血、缺氧而出现局部的坏死。由此可以推断RFA和TACE两者之间对肿瘤的杀伤作用方式不同，促进后续的肿瘤凋亡的靶点也是不同的，可以彼此增加之间的作用，有协同效应。但RFA和TACE均为有创的治疗方式，反复采用对机体影响较大，而HFH是采用高频电磁场对肿瘤组织持续杀伤的无创性治疗手段，对于加强RFA和TACE后续损伤作用更具有可操作性和易行性。本研究中TUNEL显示凋亡指数在B组可以达到（25.11±1.998）%，可见三者联合的综合治疗可以显著提高治疗的有效性。同时免疫组织化学法证实了Caspase-3在各组出现了表达，Western blot和实时荧光定量PCR法显示Caspase-3在该组表达最高。可见RFA＋TACE＋HFH联合治疗可以有效杀伤肿瘤细胞，促进肿瘤细胞的凋亡。

本研究发现B组对肝功能损伤严重，综合治疗的安全性和优势值得有待更进一步的评估。Li等[10]临床研究表明索拉菲尼与RFA、TACE的综合治疗对于晚期肝癌患者是一种效果明显且安全的治疗方法。Kim等[11]认为在治疗2～5cm的肝癌时RFA与TACE联合治疗的效果可与手术结果相比，患者的术后复发率与生存率方面比较差异不明显。在回顾性分析中，可以发现TACE联合RFA、PEI、HIFU或三维适形放疗中任一局部治疗方式，均比单一治疗效果明显，而且也能够延长晚期肝癌患者的生存时间[12-15]。由此可见，综合治疗虽然对肝功能及机体造成严重损伤，但从对晚期肝癌患者的生存时间有明显的延长作用，可以缓解症状，提高生活质量的明显优势来评估，是可以被接受和应用的。在应用综合治疗时应结合患者的病情和基本身体情况，综合评估权衡治疗对患者带来的弊与利。

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