杨硕 罗光伟 胡小萍 万军 夏倩 陈菁 袁文胜 孙洁民

对以往未经规范治疗的初诊哮喘患者，推荐按需使用短效β2受体激动剂，并选用低剂量吸入糖皮质激素或白三烯调节剂［1］。但部分患者尤其是轻症患者，往往因经济收入和顾虑激素副作用，不愿意选用控制药物。中西医结合治疗依从性更好，对这些患者病情控制可能是有益的。目前认为支气管哮喘的发病与辅助性T细胞(T helper cells，Th)亚群功能失衡、Th2活化亢进为特征的免疫学异常相关，如白细胞介素(interleukin，IL)-5、IL-10等 Th1/Th2细胞因子表达的调节异常［2］。射干麻黄汤作为哮证治疗的要方，具有较好疗效。麻黄汤是治疗哮喘寒证的经典方剂，在对难治性哮喘也具有良好的疗效，可有效改善患者肺功能［3］，本研究探讨射干麻黄汤治疗对轻症哮喘患者T细胞亚群及IL-5、IL-10表达的影响。

1 对象与方法

1.1 对象

51例研究对象来自2010年9月至2013年3月武汉市中西医结合医院呼吸科门诊，根据随机数字表分为治疗组25例和对照组26例。治疗组中男12例，女13例;年龄19～60岁，平均年龄(44.0±11.8)岁;对照组中男13例，女13例;年龄20～58岁，平均年龄(44.1±9.8)岁。两组患者性别、年龄、病情严重程度比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准

西医诊断标准参照支气管哮喘防治指南(支气管哮喘的定义、诊断、治疗和管理方案)［1］制定:符合哮喘防治指南中哮喘的诊断标准;中医辨证标准参照文献［4］制定，症见气喘，胸膈满闷如塞，咳不甚，痰少咯吐不爽，色白而多泡沫，形寒怕冷，天冷或受寒所发，舌苔白滑，辨为冷哮者。

1.3 纳入标准

年龄在18岁以上，病情为轻度发作，尚未吸入糖皮质激素治疗;中医辨证属于寒哮，能接受并完成治疗、观察和各项检查;所有患者入试前获得知情同意书。

1.4 排除标准

合并支气管扩张、肺结核等基础肺病者;有严重心、脑、肝、肾等疾病者;诱发加重或使哮喘难以控制的因素;有重度哮喘发作史;对本试验药物过敏者;妊娠和哺乳期妇女;不能依从研究方案者。

1.5 治疗方法

对照组:应用沙丁胺醇气雾剂(英国葛兰素史克制药有限公司，生产批号KR0354)100 μg，每天4次。

治疗组:在对照组的基础上加用射干麻黄汤，予中药配方颗粒(湖北天济中药饮片有限公司生产)口服，组成:射干12 g(2袋)，麻黄12 g(2袋)，细辛3 g(1袋)，生姜9 g(3袋)，大枣10 g(1袋)，紫菀12 g(2袋)，款冬花10 g(1袋)，五味子6 g(1袋)，法夏12 g(2袋)，每天1剂，早晚2次温服。两组均治疗12周。

1.6 观察指标和方法

对每位患者于治疗前后抽取外周静脉血8 mL，5 mL采用全血直标法流式细胞术检测T细胞亚群，分析 CD3+、CD4+、CD8+细胞百分率，并计算CD4/CD8比值。另3 mL肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞。将外周血单个核细胞(1×107个)用经焦碳酸二乙酯处理过的PBS液洗涤3次后移至1.5 mL的Eppendorf管中，4℃离心弃上清，用Tripure 1 mL提取总RNA，紫外线分光光度计测定其纯度和含量。引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成。应用OneStep RTPCR试剂盒(美国QIAGEN公司)，扩增目的基因，反应参数为:50℃ 30分钟;95℃ 15分钟，1个循环;94℃ 1 分钟;57℃(IL-5)、62℃(IL-10)或 65℃(β-actin)1分钟;72℃ 1分钟，32个循环;72℃延伸10分钟。

表1 RT-PCR检测用引物

凝胶扫描扩增合成的RT-PCR产物，在1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统中扫描打印，并分析测定电泳带灰度，以特异的扩增条带灰度与扩增的β-actin条带灰度之比表示目的基因相对表达水平。

1.7 疗效判定

参照文献［1］制定，分为完全控制、部分控制及未控制。(1)白天症状＞2次/周;(2)有活动受限;(3)有夜间症状/憋醒;(4)需要使用缓解药的增加次数＞2次/周;(5)1秒用力呼气容积(Forced expiratory volume in one second，FEV1)＜预计值的80%。若5项均无为完全控制，1～2项为部分控制，3项及以上为未控制。未控制者退出试验升级哮喘治疗。

1.8 统计学处理

采用SPSS 18.0软件处理数据。两组患者临床疗效比较采用秩和检验。计量资料用均数±标准差(x±s)表示，数据符合正态分布，两组间比较采用独立样本t检验，组内治疗前后的比较用配对样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者疗效比较

共5例患者试验期间症状加重并调整治疗方案，其中治疗组1例，对照组4例，其余患者均完成试验，两组患者临床疗效比较采用秩和检验，治疗组疗效优于对照组(P=0.028)，详见表2。

表2 治疗组与对照组疗效比较

2.2 两组患者治疗前后外周血T细胞亚群比较

两组间比较采用独立样本t检验，治疗前两组CD3+、CD4+、CD8+及 CD4/CD8 比值比较差异无统计学意义，治疗后两组比较:CD3+(t=0.747，P=0.459)、CD4+(t=1.806，P=0.077)、CD8+(t=1.584，P=0.120)差异无统计学意义，CD4/CD8比值明显下降(t=2.593，P=0.012)。本组治疗前后的比较用配对样本t检验，与治疗前比较，对照组 CD3+、CD4+、CD8+及 CD4/CD8比值均差异无统计学意义，治疗组 CD3+、CD4+无明显变化，CD8+增加(t=2.752，P=0.008)、CD4/CD8 比值下降(t=3.539，P=0.001)有统计意义，详见表3。

表3 各组治疗前后CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比值的比较(±s)

表3 各组治疗前后CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比值的比较(±s)

注:与本组治疗前比较，aP＜0.05;与对照组同时间点比较，bP＜0.05。

组别 CD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4/CD8治疗组治疗前 68.6±8.0 45.0±7.9 22.3±4.1 2.08±0.49治疗后 67.7±7.8 40.9±7.3 25.6±4.3a1.64±0.38ab对照组治疗前 70.9±7.9 46.2±7.8 22.8±4.2 2.10±0.53治疗后69.4±8.6 44.5±6.7 23.7±4.1 1.92±0.38

2.3 两组患者治疗前后IL-5、IL-10表达水平比较

两组间比较采用独立样本t检验，治疗前两组IL-5、IL-10 mRNA相对表达水平无明显差异，治疗后治疗组较对照组IL-5(t=2.492，P=0.016)表 达 下 降，IL-10(t=2.659，P=0.011)表达增加。本组治疗后与治疗前比较用配对样本t检验，对照组 IL-5(t=4.874，P＜0.01)明显下降，IL-10无明显改变，治疗组IL-5(t=6.946，P＜0.01)明显下降，IL-10(t=5.052，P＜0.01)明显升高，详见表4。

表4 各组治疗前后IL-5、IL-10表达水平比较

3 讨论

哮喘的治疗应以患者的病情严重程度为基础，根据其控制水平级别选择适当的治疗方案，也要考虑患者的实际状况，如经济收入和当地的医疗资源等。对以往未经规范治疗的初诊哮喘患者可选择第2级治疗方案，按需使用短效β2受体激动剂，并选用低剂量吸入糖皮质激素或白三烯调节剂。部分患者尤其是轻症患者，往往因经济收入和顾虑激素不良反应，不愿意选用指定的控制药物，而选择第1级治疗方案，该方案按需使用短效β2受体激动剂，未指定使用何种控制性药物。对这些患者，密切随访观察病情，及时升级治疗十分必要。同时，给予其他可接受的治疗，如中西医结合治疗，对患者也是有益的［5］。本研究中，与对照组比较，射干麻黄汤治疗组患者病情控制水平明显提高。

T细胞在机体细胞免疫应答中起重要作用，T淋巴细胞亚群紊乱，辅助T细胞(CD4+)水平升高，抑制T细胞(CD8+)水平下降，CD4/CD8比值失调，可导致IgE升高和气道高反应性而诱导哮喘发作［6］。哮喘患者气道阻力与CD4+T细胞及CD4/CD8比值呈显著正相关［7］，与CD8+T呈显著负相关，射干麻黄汤治疗后CD4/CD8比例的改变，有助于改善患者肺通气。射干麻黄汤治疗后患者与治疗前及对照组比较CD4+T细胞数量均有所下降，但差异无统计学意义。治疗组CD8+T细胞数量较治疗前显著增加，但与对照组比较差异无统计学意义。尽管射干麻黄汤治疗后CD4+及CD8+T细胞数量变化不显著，但CD4/CD8比例变化有统计学意义，提示对机体细胞免疫功能情况产生显著的影响。

CD4+T细胞可分泌细胞因子对体液免疫产生影响，与支气管哮喘发病密切相关。IL-5、IL-10均为Th2细胞因子，可抑制原始T细胞分化为Th1细胞及Th1细胞功能。IL-5在接触抗原后，能促进活化B淋巴细胞向产生抗体细胞分化，并诱导骨髓干细胞向嗜酸性细胞(eosinophil，EOS)增殖分化。IL-5不仅可作用于EOS前体促进其增殖分化，维持并延长成熟EOS的生存期，引起EOS趋化和黏附，还可提高抗体依赖细胞介导细胞毒作用和抗体诱导的EOS脱颗粒［8］。IL-10是重要的免疫炎症下行调节因子，它能抑制激活的CD4+T细胞的增值，抑制Th2细胞合成IL-5等多种细胞因子及炎症的发生和发展，促进Treg细胞增殖，构成免疫反应的负反馈机制［9-10］。IL-10水平的升高，有助于控制哮喘患者气道炎症与症状［11］。在本研究中射干麻黄汤治疗后虽然CD4+细胞数量影响较小，但IL-5水平显著下降，IL-10水平显著升高，提示射干麻黄汤能够调节细胞因子表达，控制哮喘的发生。

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(本文编辑:董历华)