李亚男李春雨

（1.辽宁省风沙地改良利用研究所,辽宁阜新 123000；2.阜新高等专科学校,辽宁阜新 123000）

利用抑制消减杂交技术鉴定绵羊肉质性状相关ESTs

李亚男1李春雨2*

（1.辽宁省风沙地改良利用研究所,辽宁阜新 123000；2.阜新高等专科学校,辽宁阜新 123000）

肌肉品质的遗传改良是当前畜禽育种的主要任务之一，本研究采用抑制消减杂交（SSH）技术构建不同肉用绵羊品种（道赛特与小尾寒羊）以及杂交亲代与子代（小尾寒羊与萨寒杂交羊）背最长肌的正反向消减cDNA文库，并分离差异表达EST，进行差异表达基因的全长cDNA与基因组DNA的克隆、时空表达分析，从而找到有价值的基因作为绵羊肉质性状的候选基因，并从基因表达水平上揭示不同肉用绵羊品种肉质性状差异和杂种优势的遗传基础，为绵羊基因组学的研究增加新的内容，为绵羊肉质性状的分子标记辅助选择、优质肉羊新品种或品系培育提供科学依据，为杂种优势分子预测提供新途径和方法。

1 主要内容及研究方法

1.1 不同肉羊品种以及杂交亲代与子代背最长肌的正反向消减cDNA文库的构建

本研究以辽宁省阜新市阜瑶牧业有限公司种羊场饲养的肉用绵羊为研究对象，采用抑制消减杂交（SSH）技术构建道赛特和小尾寒羊背最长肌的正反向消减cDNA文库、小尾寒羊克和萨寒杂交羊背最长肌的正反向消减cDNA文库。以管家基因B-actin作为消减指标，对每个消减文库的消减效率进行检测。

1.2 不同肉羊品种以及杂交亲代与子代背最长肌的正反向消减cDNA文库的筛选

采用PCR和斑点杂交的方法从构建好的消减文库中筛选阳性克隆。对鉴定为差异的克隆进行测序，获得的ESTs经过去载体和拼接，与非冗余蛋白质数据库进行 BLASTx 比对分析。

根据所获得的差异表达EST序列设计引物，采用RT-PCR方法对其差异表达的真实性进行验证，并进行生物信息学分析，找出与肉质性状相关的基因。

1.3 差异基因全长克隆及序列分析

对所获得的差异表达EST进行电子延伸，再根据电子延伸所获得的连续体或重叠群设计上游和下游引物。以SMART cDNA为模板，用下游引物和SMART 5’引物扩增基因的5’端，用上游引

按照党中央、国务院和云南省委、省政府关于生态文明建设和决战脱贫攻坚的决策部署，紧密联系林业现代化建设和改革发展实际，围绕增绿、增质、增效和提供更多优质生态产品以满足人民日益增长的优美生态环境需要的目标，云南省对林业供给侧结构性改革和配套措施的探索，长期走在国内前列。

物和SMART3’引物扩增3’端，然后测序拼接，获取基因的全长cDNA序列，并利用生物信息学方法对其特征进行分析。

1.4 差异基因时空表达规律分析

差异基因的不同品种间表达分析：以管家基因β-actin作为对照，利用各差异基因特异引物分析差异基因在德国肉用美利奴、道赛特、萨福克、小尾寒羊间的表达情况。

差异基因的不同发育阶段表达分析：以管家基因β-actin作为对照，利用各差异基因特异引物分析差异基因在羊各发育阶段（2、4、6、8、10、12月龄）的表达情况。

差异基因的不同组织表达分析：以管家基因β-actin作为对照，利用各差异基因特异引物分析差异基因在背最长肌、股二头肌、半棘肌、脂肪、心、肝、脾、肺、肾、胰、小肠、胃、子宫、卵巢、睾丸等组织中的表达情况。

2 主要研究成果

2.1 构建了2个肉用绵羊SSH 文库

构建了道赛特与小尾寒羊、萨寒杂交羊与小尾寒羊正反向消减cDNA文库。对构建的文库进行的差减效率检测结果表明：看家基因β-actin在没有消减组出现的循环数是23，在消减组出现的循环数是28，说明构建的差异表达基因文库的效率均是25倍，同时也表明所构建的消减文库中测试组和驱动组中共有的cDNA片断被有效杂交，差异表达于肌肉组织中的基因得到有效的富集。

2.2 筛选出9个肉质性状相关候选基因ESTs

以 T7 和 SP6 通用引物进行文库筛选，结果显示插入片段主要分布在 250～2000bp 之间，呈随机分布，其中一部分克隆的 PCR电泳结果说明构建的正反向差异表达基因的文库质量良好。对鉴定为差异的克隆进行测序比对，差异表达验证和生物信息学分析，筛选出9个肉质性状相关的具有重要功能的候选基因ESTs，如表1所示。

表1 从SSH文库筛选的肉质性状相关基因一览表

2.3 获得4个肉质性状相关差异基因全长cDNA序列

对所获得的差异表达ESTs进行电子延伸，设计引物，扩增得到4条基因全长cDNA序列。对其特征分析表明其参与调控肌肉肌苷酸合成等生理过程，与绵羊肉质风味性状紧密相关。

2.4 差异基因时空表达规律分析

利用克隆的4个基因特异引物分析差异基因在德国肉用美利奴、道赛特、萨福克、小尾寒羊间、在羊各发育阶段和不同组织的表达情况，部分差异基因表达如图所示。

图1 ADSL基因在8种组织中的差异表达分布图1-8分别为心、肝、脾、肺、肾、脑、腿肌和胸肌

3 研究成果的科学意义和应用前景

本研究成果为研究肉用绵羊肉质性状提供了基因水平的基础，能够有效推动具有我国特殊肉质性状肉用绵羊的研究进程，进而加强具有我国独特性状的绵羊品种的开发与利用，创造出广泛的社会及经济价值。

本课题所采用的理论和方法研究羊肉质风味性状的相关基因，筛选和鉴定一批对肉质性状有重要作用的功能基因，应用分子生物学、基因组学的理论与技术进行分子标记辅助选择来选种、育种，获得更符合市场需求的优良肉羊品种。一方面，项目中若干技术可以成为品种分子设计的基础研究手段，提高我省肉用绵羊育种工作的原始创新能力，另一方面，本研究也为相关育种从经验型向精确型转变，使我省绵羊育种工作建立在分子遗传学及相关学科先进理论和技术的基础上[2，3]，为提升绵羊育种的技术水平和育种效率奠定坚实的理论基础。

[1] 胡鹏飞，张贵学，于国庆，等.羔羊卵泡诱导发育、活体采卵和体外发育潜能研究[J].畜牧兽医学报，2011，42（2）：182-189.

[2] 胡鹏飞，李晓东，戴伟，等.不同水系绒螯蟹线粒体DNA 的遗传差异和群体遗传多样性研究[J].华北农学报，2008，23（3）：50-55.

李亚男（1980-），女，助理研究员，本科，研究方向为兽医临床诊疗及畜牧生产技术。

李春雨（1981-），男，讲师、国家执业兽医师，本科，研究方向为临床兽医学、高职畜牧兽医专业教学改革。