郭 睿 曹院章齐海霞 王艳红 张雪梅 王丹怡

（北京市朝阳区动物疫病预防控制中心,北京 100018）

动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方法的改良

郭 睿 曹院章＊齐海霞 王艳红 张雪梅 王丹怡

（北京市朝阳区动物疫病预防控制中心,北京 100018）

本文概述了β-受体激动剂残留检测的液相色谱-串联质谱检测方法的改进措施，比对了检测样品前处理的内标法和外标法检测结果的准确度和精密度，为实验室检测方法的实施提供参考。

β-受体激动剂 危害 内标法 外标法 准确度 精密度

β受体激动剂包括非选择性的β受体激动剂及选择性心脏β1受体激动剂，选择性β2受体激动剂等。本文主要参考农业部1025号公告-18-2008，该标准规定了动物源性食品中特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、菲诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥洛特罗和喷布特罗残留检测制样和液相色谱-串联质谱检测方法。本文中主要以测定盐酸莱克多巴胺、硫酸沙丁胺醇和盐酸克伦特罗为例，进一步阐述β-受体激动剂残留液相色谱-串联质谱检测方法在实践中采用内标法而放弃外标法的原因。

1 名词释义

内标物：将一个已知质量，样品中不含有杂质的纯物质，加入至待测样品溶液中，以此纯物质的量为标准，对比测定待测组分的含量，该纯物质称为内标物。

内标法：（internal standard method）是色谱分析中一种比较准确的定量方法，是指将一定重量的内标物，加到一定量的被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积（或峰高）及相对校正因子，按公式和方法即可求出被测组分在样品中的百分含量。

外标法：是以待测成分的对照品作为对照物质，相对比较以求得供试品含量。

准确度：指在一定实验条件下多次测定的平均值与真值相符合的程度，以误差来表示。它用来表示系统误差的大小。在实际工作中，通常用标准物质或标准方法进行对照试验，在无标准物质或标准方法时，常用加入被测定组分的纯物质进行回收试验来估计和确定准确度。

精密度：是在规定的条件下，独立测量结果间的一致程度。分析时，常用RSD表示精密度。

2 β-受体激动剂检测方法

2.1 外标法

2.1.1 原理:试料中的残留药物经酶解，用高氯酸调pH值后高速离心沉淀蛋白，上清液调pH值后分别用乙酸乙酯和叔丁基甲醚（TBME）提取，再用MCX固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法测定。

2.1.2 检测步骤

（1）样品的制备

取适量新鲜或冷冻的猪肉或猪肝组织，绞碎并匀质；

取适量新鲜或冷冻的牛奶，混合均匀；

取适量新鲜或冷冻的鸡蛋，去壳后混合均匀。

制备的猪肝、猪肉、牛奶和鸡蛋样品储存于-20℃以下备用。

（2）制备试料

取匀质的供试料品作为供试试料；

取匀质的空白样品作为空白试料；

取匀质的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液作为空白添加试料。

（3）酶解

准确称取匀浆样品2g（精确到0.01g）于50mL离心管内，加入0.2mol/L乙酸铵溶液（pH=5.2）8.0mL，再加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶40µL，涡旋混匀，于37℃下避光恒温振荡16h。

（4）提取

酶解后放置至室温，涡旋混匀，10000r/min高速离心10min，转移上清液于另一50ml离心管中，加入高氯酸溶液5ml，涡旋混匀，用高氯酸调pH至1.0±0.2，10000r/min高速离心10min，转移上清液于另一50ml离心管中，用氢氧化钠溶液调pH至9.5±0.2，加入乙酸乙酯15ml，涡旋混匀，振荡10min，5000r/min高速离心5min，取上层有机相至另一离心管中，再在下层水相中加入叔丁基甲醚10mL，涡旋混匀振荡10min，5000r/min高速离心5min，合并有机相，50℃平行蒸发至干，用甲酸水溶液5ml溶解，备用。

（5）净化

MCX固相萃取柱依次用甲醇、2%甲酸水各3ml活化，取备用液全部过柱，再依次用2%甲酸水、甲醇各3ml淋洗，抽干，用3%氨水甲醇溶液2.5ml洗脱，洗脱液在50℃下用氮气吹干，残留物用甲醇-0.1%甲酸溶液（10+90，V/V）0.2ml溶解，涡旋混匀，样液经0.2µm针孔过滤器过滤后供液相色谱-串联质谱测定。

（6）液相色谱-串联质谱条件

色谱柱：BEH C18柱，50 mm×2.1mm（i.d.），粒度1.7µm。

流动相：A相：0.1%甲酸乙腈溶液；B相：0.1%甲酸水溶液。

梯度洗脱：0～2min，维持4%A；2～12min，4%A线性变化至60%A；12～12.1min，60%A线性变化至4%A；12.1～16min，维持4%A。

流速：0.3ml/min。

进样量：10µl。

柱温：30℃。

离子源：电喷雾ESI正离子。

扫描方式：多反应监测MRM。然后以30℃/min升至260℃，保持1min，再以20℃/min升至280℃，保持2min，直至样品的组分全部流出。

监测离子对：

沙丁胺醇m/z 240.1-147.7（定量离子）、240.1-221.9；

克伦特罗m/z 277.1-202.8（定量离子）、277.1-258.9；

莱克多巴胺m/z 302.3-106.7（定量离子）、302.3-163.8；

（7）质谱分析

在上述工作条件下，通过仪器工作软件绘制标准曲线，以色谱峰面积定量。

（8）液相色谱-串联质谱确证

按上述工作条件测定样品和标准工作液，分别计算样品和标准工作液中非定量离子与定量离子对色谱峰面积的比值，仅当两者数值的相对标准偏差小于25%时方可确定两者为同一物质。

（9）准确度

本方法在0.25～2µg/kg添加浓度范围内，用空白添加校准校正，其回收率范围为70%～120%。

（10）精密度

本方法批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。

（11）结果判定

β-受体激动剂液相色谱-串联质谱检测法的方法检出限为0.25µg/kg，定量限为0.5µg/kg，判定检测结果大于0.5µg/kg时为阳性。

2.2 内标法

2.2.1 原理:试料中的残留药物经酶解，用高氯酸调pH值后高速离心沉淀蛋白，上清液调pH值后分别用乙酸乙酯和叔丁基甲醚（TBME）提取，再用MCX固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法测定。

2.2.2 检测步骤

（1）样品的制备

取适量新鲜或冷冻的猪肉或猪肝组织，绞碎并匀质；取适量新鲜或冷冻的牛奶，混合均匀；

取适量新鲜或冷冻的鸡蛋，去壳后混合均匀。

制备的猪肝、猪肉、牛奶和鸡蛋样品储存于-20℃以下备用。（2）制备试料

取匀质的供试料品作为供试试料；取匀质的空白样品作为空白试料；取匀质的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液作为空白添加试料。

在所有的供试试料、空白试料和空白添加试料中都加入等量的适宜浓度的内标标准工作液。

（3）酶解

准确称取匀浆样品2g（精确到0.01g）于50ml离心管内，加入0.2mol/L乙酸铵溶液（pH=5.2）8.0ml，再加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶40µl，涡旋混匀，于37℃下避光恒温振荡16h。

（4）提取

酶解后放置至室温，涡旋混匀，10000r/min高速离心10min，转移上清液于另一50ml离心管中，加入高氯酸溶液5ml涡旋混匀，用高氯酸调pH至1.0±0.2，10000r/min高速离心10min，转移上清液于另一50ml离心管中，用氢氧化钠溶液调pH至9.5±0.2，加入乙酸乙酯15ml，涡旋混匀，振荡10min，5000r/min高速离心5min，取上层有机相至另一离心管中，再在下层水相中加入叔丁基甲醚10ml，涡旋混匀振荡10min，5000r/min高速离心5min，合并有机相，50℃平行蒸发至干，用甲酸水溶液5mL溶解，备用。

（5）净化

MCX固相萃取柱依次用甲醇、2%甲酸水各3ml活化，取备用液全部过柱，再依次用2%甲酸水、甲醇各3ml淋洗，抽干，用3%氨水甲醇溶液2.5ml洗脱，洗脱液在50℃下用氮气吹干，残留物用甲醇-0.1%甲酸溶液（10+90，V/V）0.2ml溶解，涡旋混匀，样液经0.2µm针孔过滤器过滤后供液相色谱-串联质谱测定。

（6）液相色谱-串联质谱条件

色谱柱：BEH C18柱，50 mm×2.1mm（i.d.），粒度1.7µm。

流动相：A相：0.1%甲酸乙腈溶液；B相：0.1%甲酸水溶液。

梯度洗脱：0～2min，维持4%A；2～12min，4%A线性变化至60%A；12～12.1min，60%A线性变化至4%A；12.1～16min，维持4%A。

流速：0.3ml/min。

进样量：10µl。

柱温：30℃。

离子源：电喷雾ESI正离子。

扫描方式：多反应监测MRM。然后以30℃/min升至260℃，保持1min，再以20℃/min升至280℃，保持2min，直至样品的组分全部流出。

监测离子对：

沙丁胺醇m/z 240.1-147.7（定量离子）、240.1-221.9；

克伦特罗m/z 277.1-202.8（定量离子）、277.1-258.9；

莱克多巴胺m/z 302.3-106.7（定量离子）、302.3-163.8；

氘代沙丁胺醇m/z 240.1-147.7（定量离子）；

氘代克伦特罗m/z 277.1-202.8（定量离子）；

氘代莱克多巴胺m/z 302.3-106.7（定量离子）。

（7）质谱分析

在上述工作条件下，通过仪器工作软件绘制标准曲线，以色谱峰面积按内标法定量，沙丁胺醇以氘代沙丁胺醇为内标物计算，克伦特罗以氘代克伦特罗为内标物计算，莱克多巴胺以氘代莱克多巴胺为内标物计算。

（8）液相色谱-串联质谱确证

按上述工作条件测定样品和标准工作液，分别计算样品和标准工作液中非定量离子与定量离子对色谱峰面积的比值，仅当两者数值的相对标准偏差小于25%时方可确定两者为同一物质。

（9）准确度

本方法在0.25µg/kg～2µg/kg添加浓度范围内，用空白添加校准校正，其回收率范围为80%～110%。

（10）精密度

本方法批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤15%。

（11）结果判定

β-受体激动剂液相色谱-串联质谱检测法的方法检出限为0.25µg/kg，定量限为0.5µg/kg，判定检测结果大于0.5µg/kg时为阳性。

3 比对

实验次目外标法内标法准确度（添加回收率%）精密度（RSD%）曲线相关系数准确度（添加回收率%）精密度（RSD%）曲线相关系数20150128115～12028.90～31.330.9944～0.9962105～108.50～2.660.9995～0.9998 20150212125～1608.58～12.400.9082～0.9243100～1104.76～8.250.9988～0.9998 201504170～1021.42～56.780.3244～0.378080～93.34.22～4.680.9976～0.9989 2015041890～1609.12～14.320.9748～0.999780～1105.59～7.530.9891～0.9990

4 结语

通过多次实验结果准确度和精密度的比对，可以清楚地判断β-受体激动剂的液相色谱-串联质谱检测的内标法优于外标法。内标法灵敏度高，定性准确，可以更有效地保证准确性的稳定性，精密度的一致性，同时保证校正曲线的相关系数达到实验的要求，在一定程度上保证实验有效，出具结果准确，因此，我们在临床实验中将β-受体激动剂的液相色谱-串联质谱检测外标法改进为内标法。

郭睿（1981-），职称:中级兽医师，研究方向:实验室管理及检测。

曹院章（1966-），职称:中级兽医师，研究方向:检疫及兽药残留检测。