秦香香 高梦月 苏玲玲 成大荣

(扬州大学兽医学院,江苏扬州 225009)

鸭疫里默氏杆菌的PCR检测和药敏试验

秦香香 高梦月 苏玲玲 成大荣*

(扬州大学兽医学院,江苏扬州 225009)

合成两条鸭疫里默氏杆菌特异性引物，建立PCR方法。使用模板进行基因扩增，得到592bp的目的条带。以该方法对高邮、仪征等地的疑似病例进行检测，得到20株鸭疫里默氏杆菌。挑选鉴定后的纯菌落接种含血清TSB液体培养基，增菌后进行药敏试验。结果显示，所有被检鸭疫里默氏杆菌菌株对哌拉西林、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、头孢西丁的敏感率均达到了100%；对头孢唑啉、头孢哌酮、头孢吡肟的敏感率达到了95%。

鸭疫里默氏杆菌 PCR 药敏试验

我国鸭品种资源丰富，同时是世界上最大的鸭生产国。随着科学养殖技术的推广以及集约化规模的提高，养鸭业已经是我国的重要产业，并成为农民就业、脱困、增收的新亮点。

但是，多年来，鸭病一直阻碍着养鸭业的发展，特别是鸭疫里默氏杆菌的感染。鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌感染引起的一种接触感染性疾病，该病主要侵害1～8周龄（尤其2～3周龄）雏鸭、雏鹅、雏火鸡等[1]。在临床上主要以神经症状和纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征，是目前造成养鸭业经济损失最为严重的传染病之一，其发病率可达90%以上，死亡率高达75%以上[1-4]。饲养管理水平差，应激因素的影响，缺乏维生素和微量元素，均能诱发本病和加剧死亡。扬州高邮、仪征地区为养鸭密集区，本研究旨在建立鸭疫里默氏杆菌的快速检测方法，并对病原菌进行药敏试验，了解当前临床常用药物对本地鸭疫里默杆菌的敏感度，找出有效的治疗药物，为当地鸭疫里默杆菌病的防治工作提供参考依据。

1 材料

1.1 病料来源

2013年9月至2014年5月，从扬州大学动物医院收集来自扬州高邮、仪征，临床表现有心包炎、肝周炎等典型症状的病死鸭、鹅，无菌采集其肝脏、心脏、脾脏、脑等组织，-20℃冻存备用。此外，还有家禽研究所送检的5株疑似菌株。

1.2 培养基

TSB液体培养基和TSA固体培养基（含5%小牛血清），由本实验室配制。

1.3 药敏纸片

革兰阴性菌药敏试剂盒，由杭州天和微生物试剂有限公司生产。

1.4 主要试剂及仪器

1.4.1 主要试剂

Taq酶、dNTPs、10×Buffer、DNA Marker DL1000、6×Loading Buffer，均由生工生物工程（上海）股份有限公司生产。

1.4.2 主要仪器

烛缸；冷冻离心机；基因扩增仪；电泳仪；凝胶成像仪。

2 方法

2.1 引物的设计

合成扩增RA的引物[5]，两条引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列及产物

2.2 DNA模板的制备

TSB液体培养基培养的细菌，取培养物600μl以12 000 r/min离心10 min，去除上清后悬浮于50μl灭菌超纯水中；TSA固体培养基培养的细菌，挑取单菌落悬浮于100μl灭菌超纯水中。采用热煮沸法制备细菌的DNA模板[6]。

2.3 PCR反应

采用25μl反应体系，其中10 × buffer 2.5μl，dNTP 2μl，Taq酶0.25 μl，RA上、下引物各0.25 μl，细菌模板1μl，补加灭菌超纯水18.75μl至25μl。PCR反应条件为94℃预变性5 min；94℃ 30 s，54.3℃ 60 s，72℃ 45 s，30个循环；72℃延伸10 min。PCR反应结束后取8μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪下观察结果。

2.4 特异性试验

将鸭疫里默氏杆菌菌株，禽致病性大肠杆菌菌株，鸭源性多杀性巴氏杆菌菌株，鸭源性沙门氏菌菌株复苏培养后，按2.3的条件进行PCR反应以检验所建立方法的特异性。

2.5 PCR方法的应用

对扬州大学动物医院送检的病死鸭、鹅（具有心包炎、肝周炎和脑膜炎等病变）进行剖检。

无菌剪取病料置于5 mlTSB液体培养基，37℃振摇培养8 h。取培养物划线接种于TSB琼脂平板，置于含 5%～10% CO2的蜡烛罐中37℃培养24 h[7]。另取部分培养物连同家禽研究所送检的疑似RA菌株5株，按2.2步骤提取模板，按2.3的方法进行PCR扩增和鉴定。

2.6 药敏试验

挑选鉴定后的纯菌落接种TSB液体培养基过夜培养，取增菌液200μl均匀涂布平板，贴药敏纸片，置于含 5%～10% CO2的蜡烛罐中37℃培养24 h，测定抑菌环直径并记录。

3 实验结果

3.1 PCR检测结果

所有RA菌株均扩增出592bp的特异条带，ddw对照未能扩增出条带。

图1 PCR检测结果

3.2 PCR扩增的特异性

RA扩增出592 bp的单一片段，禽致病性大肠杆菌、鸭源性多杀性巴氏杆菌、鸭源性沙门氏菌、ddw对照未能扩增出条带（图1）。

图2 特异性检测结果

表3 鸭疫里默氏杆菌的药物敏感性试验结果药物判定标准/mm结果/株

3.3 PCR方法的临床检测结果

18份疑似病例和5株疑似菌株分离鉴定结果和PCR的鉴定结果一致，证明了该PCR检测方法的可靠性。结果显示，18份病例中有15份检测出RA感染，检测结果阳性率为83.3%。疑似菌株的检测结果均为阳性。详见表2。

表2 临床病例和疑似菌株的细菌分离和PCR鉴定结果

3.4 药敏试验结果

根据判定标准：鸭疫里默氏杆菌对头孢哌酮、头孢曲松、头孢他啶、头孢西丁等高度敏感，对妥布霉素、链霉素、卡那霉素等高度耐受。药敏试验结果详见表3。

浪费。本研究结果表明：所有被检鸭疫里默氏杆菌菌株对哌拉西林、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、头孢西丁的敏感率均达到了100%；对头孢唑啉、头孢哌酮、头孢吡肟的敏感率达到了95%；对头孢噻吩、头孢曲松敏感率达到了75%。说明扬州高邮、仪征地区在养殖过程中做到了合理的用药，没有产生大规模耐药的现象，对头孢类药物仍较为敏感。

4 讨论

雏鸭常发生一种呈现高发病率和死亡率的急性传染病，剖检可见心包炎、肝周炎和气囊炎等典型变化，这种病症多数为鸭疫里默氏杆菌感染所致[8]。从脑实质内最易分离到病原菌，初次分离需要在血液琼脂平板和有5%～10%CO2条件下才能成功分离培养，费时且条件苛刻[9]。本研究合成了两条特异性引物，通过PCR均能获得特异性结果，节省了时间，增强了实际应用性。临床病例的细菌分离和检测结果进一步说明了该方法的准确性和可靠性。

来源不同的鸭疫里默氏杆菌对药物敏感性各不一致[10-11]。因此，在治疗时要进行敏感药物筛选，以免造成药物和生产上的

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成大荣（1973-），男，教授，博士，研究方向为兽医微生物学和免疫学。

江苏省大学生实践创新训练计划、江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）