柴新义，安双登，盛 硕，苏 海

(滁州学院 生物与食品工程学院， 安徽 滁州 239000)

产漆酶真菌筛选及其产酶条件的优化

柴新义，安双登，盛 硕，苏 海

(滁州学院 生物与食品工程学院， 安徽 滁州 239000)

【目的】 从11株野生大型真菌中筛选具有产漆酶活性的大型真菌，并对漆酶活性较高的菌株进行产酶发酵条件优化，为将其投入工业化生产提供参考。【方法】 以采集自安徽省琅琊山的11株真菌为材料，通过平板显色反应，筛选具有产漆酶活性的大型真菌菌株，再用液体摇瓶发酵培养方法优化大型真菌产酶培养基的组成，并对优化条件进行验证。【结果】 ①在供试的11株野生大型真菌中，有6株具产漆酶活性，占54.5%；其中有柄树舌灵芝(Ganodermagibbosum) CZSWXY0001具有较高的产漆酶能力，其产酶培养基的最佳碳源为蔗糖，氮源为酵母膏。②优化后的培养基配方为：蔗糖20 g/L，酵母膏 2 g/L，K2HPO43.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS) 3 mg/L，Cu2+浓度6 mmol/L，pH 7.0。培养基优化后,有柄树舌灵芝菌株所产漆酶活性达到496.18 U/mL，约是优化前的12.2倍。【结论】 有柄树舌灵芝CZSWXY0001具有较好的产漆酶活性。

漆酶；有柄树舌灵芝；酶活力；发酵条件

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在于植物、真菌、细菌、昆虫中，担子菌中的白腐菌是漆酶最重要的生产者之一[1-3]，漆酶由于有着广阔的应用价值而备受关注，是生物科学、化学、食品工业、环境保护和造纸工业等众多领域的应用研究热点[4-6]。目前，从野生大型真菌中筛选高产漆酶菌种的研究报道较少，为筛选具有较高产漆酶活性的野生大型真菌菌种,探讨工业化液体产酶条件，本试验对采集自安徽省琅琊山森林保护区的11株野生大型真菌，进行高产漆酶活性菌株初筛、复筛，并对筛选出的菌株培养条件进行优化，以期为将该菌株用于工业化生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株 用于试验研究的野生大型真菌共11株，均从安徽省琅琊山森林自然保护区采集分离获得。菌种保存于滁州学院生物与食品工程学院微生物研究室。

1.1.2 培养基 (1)PDA培养基。马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15 g/L。该培养基主要用于大型真菌的分离、纯化、保存和菌种的活化等。

(2)愈创木酚PDA培养基。在PDA培养基中添加0.04%(质量分数)的愈创木酚。该培养基主要用于具有产漆酶活性大型真菌的初筛。

(3)液体种子培养基。马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母膏5.0 g/L,KH2PO43.0 g/L,MgSO4·7H2O 3.0 g/L，VB110.0 mg/L。该培养基主要用于培养具有产漆酶活性的大型真菌的液体菌种。

(4)液体产酶培养基。葡萄糖20 g/L，NH4Cl 2.5 g/L,K2HPO43.2 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CuSO4·5H2O 0.006 g/L,pH自然。该培养基主要用于具有较高产漆酶能力大型真菌的复筛及产酶条件的优化。

1.2 方 法

1.2.1 高产漆酶活性菌株的筛选 (1)初筛。应用愈创木酚PDA培养基，通过平板显色反应的方法，对野外采集分离的11株大型真菌菌株进行初筛试验，于22 ℃恒温培养箱中培养7 d后，测量菌落和变色圈的大小，初筛出生长快且具有产漆酶活性的大型真菌菌株。每菌株3个重复。

(2)复筛。运用液体产酶培养基对初筛出的大型真菌菌株进行液体发酵培养，利用分光光度计测定吸光值，并计算酶活性，复筛出具有较高产漆酶活性且产酶稳定的大型真菌菌种，并将其作为优化产漆酶培养条件的菌种。

1.2.2 液体菌种的制备 在250 mL锥形瓶中装入50 mL的液体种子培养基，将复筛的菌株接种至液体种子培养基中，在转速为150 r/min、28 ℃的恒温振荡培养箱中培养72 h，4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3 漆酶的发酵培养 在250 mL锥形瓶中装入70 mL的液体产酶培养基，将液体种子培养基按照10%(体积分数，下同)的接种量接种至液体产酶培养基中，在转速为150 r/min、28 ℃的恒温振荡培养箱中培养7 d。

1.2.4 漆酶的制备 将1.2.3中培养的发酵液于4 500 r/min 离心15～20 min，取上清液，即为漆酶的粗酶液。

1.2.5 漆酶酶活性的测定 在4 mL pH 6.0的0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液 (含有1 mL 1 mol/L愈创木酚)中,加入1 mL稀释的漆酶粗酶液，混合均匀后，于25 ℃反应10 min，在465 nm处测定吸收值的增量。漆酶酶活性定义为：在上述条件下，每分钟催化1 μmol底物所需要的酶量为1个酶活性单位，即1 U。

1.2.6 漆酶发酵培养基组分的优化 (1)最适碳源的筛选。在液体产酶发酵培养基中，分别以20 g/L的葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、麸皮、玉米粉、CMC-Na为惟一碳源。将培养的有柄树舌灵芝CZSWXY0001液体菌种，分别按10%的接种量接入液体发酵培养基中，在摇床转速150 r/min、25 ℃下培养7 d，分别测定酶活性大小，每处理3个重复。

(2)最适氮源的筛选。在液体产酶发酵培养基中，分别以 2 g/L的 NH4Cl、NaNO3、(NH4)2SO4、蛋白胨、酵母膏、尿素为惟一氮源。其余同碳源试验。

(3)最适起始pH值的确定。分别调节产酶起始pH值为4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0。接种量为10%，150 r/min培养7 d，分别测定漆酶活性大小，每处理3个重复。

(4)最适表面活性剂的确定。在液体产酶发酵培养基中,分别加入Tween80、SDS(十二烷基硫酸钠)和PEG(聚乙二醇)作为表面活性剂，且每种表面活性剂分别设置1，3和5 mg/L 3个处理。培养及测定同碳、氮源试验。

(5)最适Cu2+浓度的确定。在液体产酶培养基中，调节CuSO4的加入量，使Cu2+的浓度分别为2,4,6,8 和10 mmol/L。培养及测定同碳源试验。

(6)最适温度的确定。将液体产酶发酵培养基分别置于20,25,30,35,40 ℃条件下，接种量为10%，摇床转速150 r/min，培养7 d，分别测定漆酶活性大小，每处理3个重复。

1.2.7 数据处理 试验数据运用Excel 2003软件和DPS7.55软件处理。多重比较采用Duncan’s新复极差法，比较不同处理间菌落生长及产漆酶能力的差异。

2 结果与分析

2.1 产漆酶活性菌株的筛选

2.1.1 菌株的初筛 表1表明，供试的11株真菌中，有6株具有较好的产漆酶活性，占54.5%；但不同菌株之间的菌落生长速度存在较大差异，其中以云芝CZSWXY0003 和有柄树舌灵芝CZSWXY0001的生长速度最快，与其他菌株之间存在极显著差异；从产漆酶形成变色圈的直径大小来看，有柄树舌灵芝CZSWXY0001最大，与其他各菌株之间有极显著差异。综合比较初筛结果认为，有柄树舌灵芝CZSWXY0001为最佳的产漆酶活性菌株。

注：同列数据后标不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05)，标不同大写字母表示差异达极显著水平(P<0.01)。下同。

Note:Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05) and different capital letters indicate highly significant difference (P<0.01).The same below.

2.1.2 菌株的复筛 对初筛出来的6株真菌进行液体发酵培养，结果(表2)表明，这6株真菌产漆酶活性有一定差异，大小顺序依次为：CZSWXY0001>CZSWXY0003>CZSWXY0006>CZSWXY0002>CZSWXY0005>CZSWXY0004，其中以有柄树舌灵芝CZSWXY0001的产漆酶活性最强，与其余菌株之间差异极显著，与初筛结果基本一致。所以，以有柄树舌灵芝CZSWXY0001作为目标菌株进行后续研究。

2.2 漆酶发酵培养条件的优化

2.2.1 最适碳源的筛选 由图1可以看出，不同碳源对有柄树舌灵芝CZSWXY0001所产漆酶活性的影响有差别，蔗糖作为碳源时酶活性最强(41.67 U/mL),且与其他碳源间差异极显著。因此，以蔗糖作为有柄树舌灵芝CZSWXY0001产漆酶的最适碳源。

2.2.2 最适氮源的筛选 图2表明，不同氮源物质对有柄树舌灵芝CZSWXY0001所产漆酶活性的影响不同，以酵母膏为氮源时，酶活性最强(36.33 U/mL)，且与其他氮源之间差异极显著。因此，选择酵母膏作为有柄树舌灵芝CZSWXY0001产漆酶的最适氮源。

2.2.3 最适起始pH值的确定 图3表明，漆酶生产受培养基pH值的影响较为明显，当液体产酶培养基的初始pH值为7时，有柄树舌灵芝CZSWXY0001所产漆酶活性最高，与其他pH值之间差异极显著；pH值大于或低于7，菌株产漆酶活性均会受到不同程度的影响。

2.2.4 最适表面活性剂的确定 图4表明，表面活性剂对有柄树舌灵芝CZSWXY0001所产漆酶活性的影响不同，以3 mg/L SDS(十二烷基硫酸钠)最有利于漆酶的生产。

图1 不同碳源对有柄树舌灵芝CZSWXY001产漆酶活性的影响标不同小写字母者表示差异达显著水平(P<0.05)，标不同大写字母表示差异达极显著水平(P<0.01)。下图同
Fig.1 Effect of different carbon sources on laccase-producing activity ofGanodermagibbosumCZSWXY001Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05),and capital letters indicate highly significant difference (P<0.01).The same below

图2 不同氮源对有柄树舌灵芝CZSWXY001产漆酶活性的影响
Fig.2 Effect of different nitrogen sources on laccase-producing activity ofGanodermagibbosumCZSWXY001

2.2.5 最适Cu2+浓度的确定 图5表明，Cu2+浓度为6 mmol/L时，有柄树舌灵芝产漆酶的效果最佳，且与其他处理之间差异显著；随着Cu2+浓度的继续增加，菌株的产漆酶活性降低，产生抑制作用。故在生产实践中可选用6 mmol/L Cu2+作为有柄树舌灵芝CZSWXY0001产漆酶培养基中的最适Cu2+浓度。

2.2.6 最适温度的确定 图6表明，温度对有柄树舌灵芝CZSWXY0001所产漆酶活性有一定的影响，25 ℃时产漆酶活性最强，达64.67 U/mL，且与其他温度间差异极显著。培养温度过高或过低都不利于真菌漆酶的生产。

2.3 真菌菌株产漆酶优化条件的验证

根据单因素试验结果，配制优化培养基，其中蔗糖20 g/L，酵母膏 2 g/L,K2HPO43.2 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L，表面活性剂SDS 3 mg/L,Cu2+浓度6 mmol/L,pH 7.0。比较优化后培养基与原培养基所产漆酶活性的高低发现，培养基优化后，有柄树舌灵芝CZSWXY0001所产漆酶活性达到496.18 U/mL，约是优化前(40.67 U/mL)的12.2倍。

3 讨 论

真菌漆酶对碳源的利用程度和效率不同。本研究结果显示，蔗糖作为碳源时有柄树舌灵芝CZSWXY0001产漆酶活性最强(41.67 U/mL),且与其他碳源差异极显著。说明真菌漆酶对不同碳源的利用程度和效率不同，许多研究也证实了该点[7-9]。许多研究还证实，有机氮源对真菌产漆酶的影响优于无机氮源[7，9-10]，这可能与有机氮源富含各种氨基酸，可直接被菌体吸收利用有关。但也有研究证明，无机氮源为真菌产漆酶的最佳氮源[11-12]。这些研究结果的差异，可能是由于不同真菌对不同氮源物质的利用程度和效率存在差异所致。

有研究表明，真菌产漆酶的最适pH值是偏酸性的[10-11，13]。本研究表明，当液体产酶培养基的初始pH值为7时，有柄树舌灵芝CZSWXY0001的产漆酶活性最高，且与其他pH值之间差异极显著，初始pH大于或低于7，其产漆酶活性均受到不同程度的影响。由于酶的活性部位通常含有非常重要的碱性或酸性基团，所以每一种酶都会有自己最适的pH值。另外，最适pH值不同可能也与真菌所属种类及其生物学特性不同有关。

本研究结果显示，不同的表面活性剂及其质量浓度对有柄树舌灵芝CZSWXY0001所产漆酶活性的影响不同，以3 mg/L SDS(十二烷基硫酸钠)最有利于漆酶的生产。也有研究表明，非离子型表面活性剂如吐温80 等对真菌产漆酶有较强的促进作用，而离子型表面活性剂如 SDS 等则明显抑制产酶[14]。目前，有关表面活性剂对真菌产漆酶的影响机制尚无一致结论[12，15]，其对真菌产漆酶的影响可能是多方面的。

温度对有柄树舌灵芝CZSWXY0001所产漆酶活性有一定的影响，本研究结果表明，25 ℃时产漆酶活性最强，这与许多研究结果(真菌的最适产酶温度在 25～31 ℃)基本一致[10，14，16]。

有些研究证明，在产漆酶培养基中添加一些含有木质素的物质可提高木腐菌的产漆酶能力[17-19]。如王宜磊[17]研究证实，麦麸可使彩绒革盖菌Coriolusversicolor所产漆酶活性由 131 U/mL 提高到622 U/mL；赵文娟等[19]研究证明，麦麸对裂褶菌产漆酶有促进作用，且其产漆酶量与添加麦麸量有直接关联。但也有一些研究证实，麦麸并非真菌产漆酶的最佳碳源[8-10]，这与本研究结果一致，推断可能是因为不同的碳源物质对不同种类真菌产漆酶的影响有别，特别是培养基中添加天然植物物料时，到底是物料的何种成分在起作用，也值得深入研究。

目前，许多产漆酶真菌的筛选和应用仍是在实验室条件下进行的，几乎未涉及到实际生产上的应用。因此，进一步开展应用于生产实际的研究，将具有巨大的经济意义和社会意义。

[1] 钞亚鹏，钱世钧.真菌漆酶及其应用 [J].生物工程进展，2001，21(5)：23-28.

Chao Y P,Qian S J.Fungal laccase and its applications [J].Progress in Biotechnology,2001,21(5):23-28.(in Chinese)

[2] Chen S H,Williamson P R.Lessons from cryptococcal laccase:From environmental saprophyte to pathogen [J].Current Fungal Infection Reports,2011,5(4):233-244.

[3] 杨启青，曹支敏，胡景江.几种木腐菌漆酶活性的研究 [J].西北林学院学报，2003，18(2)：58-60.

Yang Q Q,Cao Z M,Hu J J.Study on laccase activities of wood-rot fungi [J].Journal of Northwest Forestry University,2003,18(2):58-60.(in Chinese)

[4] 吴 坤，朱显峰，张世敏，等. 杂色云芝产漆酶的发酵条件研究 [J].菌物系统，2001，20(2)：207-213.

Wu K,Zhu X F,Zhang S M,et al.Studies on fermentation conditions for laccase production fromCoriolusversicolor[J].Mycosystema,2001,20(2):207-213.(in Chinese)

[5] Christopher F.The structure and function of fungal laccase [J].Microbiology,1994,140(1):19-26．

[6] Arora D S,Sharma R H.Ligninolytic fungal laccases and their biotechnological applications [J].Applied Biochemistry Biotechnology,2010,160:1760-1788.

[7] 范文霞，蔡友华，刘学铭，等．毛云芝菌产漆酶液体培养条件的优化 [J].食品与生物技术学报，2008，27(3)：88-93．

Fan W X,Cai Y H,Liu X M,et al.Optimization of liquid culture conditions for laccase production byCoriolushirsutus[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2008,27(3):88-93.(in Chinese)

[8] 莫佳琳，付时雨，詹怀宇，等．白腐菌液体培养产生漆酶的研究 [J].纤维素科学与技术，2008，16(1)：13-19．

Mo J L,Fu S Y,Zhan H Y,et al.Study on laccase production by white-rot fungus in submerged culture [J].Journal of Cellulose Science and Technology,2008,16(1):13-19.(in Chinese)

Hansen等研究了新产品开发活动中创意的创新价值链，类似于创意生成、筛选、开发及扩散的过程。但是只重点分析了大型分散的跨国公司，这个创新流程不适合小型、单个单元的公司。这些相关模型都是新产品开发（NPD）的原型，基本都认为产品创新过程是一个线性顺序阶段：创意生成、创意筛选、研究开发、投放市场。Hartono提出了一个整体性的三部创新过程，创意产生阶段（结合外部伙伴和内部单元进行研发活动）、转化阶段（整合新创意转为创新输出）、运用阶段（创新成品和公司绩效）。以能力为基础的开发新创意的模型，以整合新创意与公司能力为视角，在一个更宽广的内外部知识资源及创新活动基础上，研究新产品的创新流程。

[9] 董学卫，朱启忠，于秀敏，等．白毒鹅膏菌漆酶的诱导及其对直接黑G的脱色作用 [J].工业水处理，2008，28(9)：70-73．

Dong X W,Zhu Q Z,Yu X M,et al.Inducement of laccase production byAmanitavernaand its use for the decolorization of azo dye [J].Industrial Water Treatment,2008,28(9):70-73.(in Chinese)

[10] 陶 君，马爱民，郭爱玲，等．灵芝漆酶活性的测定及其产漆酶条件的优化 [J].食品科学，2008，29(3)：310-313．

Tao J,Ma A M,Guo A L,et al.Detection of laccase activity and optimization of conditions on laccase production byGanodermalucidum[J].Food Science,2008,29(3):310-313.(in Chinese)

[11] 王 超，余学军，张琳琳，等.虫拟蜡菌固态发酵产漆酶条件优化 [J].中国食品学报，2013，13(6)：97-103．

Wang C,Yu X J,Zhang L L,et al.Optimization of the conditions for producing laccase ofCeriporiopsissubvermisporunder solid-state fermentation [J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2013,13(6):97-103.(in Chinese)

[12] 刘文华，蔡宇杰，范晶晶，等.毛栓菌产漆酶条件优化及该酶对合成染料脱色的特性 [J].微生物学通报，2013，40(5)：727-738．

Liu W H,Cai Y J,Fan J J,et al.The optimization on laccase production fromTrameteshirsuteand its property in the decolorization of synthetic dyes [J].Microbiology China,2013,40(5):727-738.(in Chinese)

[13] 张 玉，洪 枫．优化培养条件对提高香菇漆酶产量的研究 [J].林产化学与工业，2006，26(2)：74-78．

Zhang Y,Hong F.Study on optmization of culture conditions for improved production ofLentinulaedodeslaccase [J].Chemistry and Industry of Forest Product,2006,26(2):74-78.(in Chinese)

[14] 刘家扬，蔡宇杰，廖祥儒，等．漆酶高产菌的筛选及产酶优化 [J].食品与机械，2010，26(4):10-14．

Liu J Y,Cai Y J,Liao X R,et al.Screening and optimization of laccase production on from a laccase producing fungal [J].Food and Machinery,2010,26(4):10-14.(in Chinese)

[15] 李越中，高培基，王祖农．黄孢原毛平革菌合成木素过氧化物酶的营养调控 [J].微生物学报，1994，34(1)：26-36．

Li Y Z,Gao P J,Wang Z N.Nutritional regulation of synthesis of lignin peroxidase byPhanerochatechrysosporiumMe-446 [J].Acta Microbiologica Sinica,1994，34(1)：26-36．(in Chinese)

[16] 赵凤霞，张 莉．白腐菌TrametespubescensMB89 产漆酶发酵条件的优化及其部分酶学性质的研究 [J].西北农业学报，2009，18(4)：175-180．

Zhao F X,Zhang L.Optimization of cultivation conditions and properties of laccase from white rot fungusTrametespubescensMB89 [J].Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica,2009,18(4):175-180.(in Chinese)

[17] 王宜磊.高酶活菌株的筛选及漆酶特性 [J].微生物学杂志,2004，24(1)：11-13．

Wang Y L.Studies on the properties of laccase and screening for high yield laccase producing fungi [J].Journal of Microbiology,2004,24(1):11-13．(in Chinese)

[18] 王佳玲，余惠生，付时雨，等．白腐真菌漆酶的研究进展 [J].微生物学通报，1998，25(4)：233-236．

Wang J L,Yu H S,Fu S Y,et al.The research progress of white-rot fungus laccase [J].Microbiology China,1998,25(4):233-236.(in Chinese)

[19] 赵文娟，徐升运，任 平.产漆酶裂褶菌的筛选及其产酶培养条件优化研究 [J].湖北农业科学，2013，52(12):2792-2797.

Zhao W J,Xu S Y,Ren P.Isolation ofSchizophyllumcommuneproducing laccase and optimization of laccase production conditions [J].Hubei Agricultural Sciences,2013,52(12):2792-2797.(in Chinese)

Screening of laccase-producing wild macrofungi and optimization of production conditions

CHAI Xin-yi,AN Shuang-deng,SHENG Shuo,SU Hai

(SchoolofBiologyandFoodEngineering,ChuzhouUniversity,Chuzhou,Anhui239000,China)

【Objective】 The specific objectives of the study were to screen laccase-producing wild macrofungi from 11 strains and optimize their optimal production conditions,which could improve the industrialization of laccase-producing strains.【Method】 11 wild fungi strains collected from Langya Mountain in Anhui were studied to screen strains with laccase-producing ability through the plate-color reaction.Shake flask culturing method was then used to get optimal culture media and conditions.【Result】 (1) 6 out of the 11 tested strains had laccase-producing activity with the ratio of 54.5%.Ganodermagibbosumhad the highest laccase-producing ability with the best carbon and nitrogen sources of sucrose and yeast extract,respectively.(2) The optimal medium was:sucrose 20 g/L,yeast 2 g/L,K2HPO43.2 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,surfactant sodium dodecyl sulfate (SDS) 3 mg/L,and copper ion concentration 6 mmol/L at the pH of 7.0.Enzyme activity under the optimal conditions was 496.18 U/mL,which was 12.2 times of the original medium.【Conclusion】 Ganoderma gibbosum CZSWXY0001 had good-laccase producing ability.

Laccase;Ganodermagibbosum;enzyme activity;fermentation conditions

2013-11-02

安徽省教育厅自然科学基金项目(KJ2012Z287)；滁州学院生物工程科技创新团队项目(CZTD201104)；滁州学院科研启动基金项目(2014qd047)

柴新义(1978-)，男，安徽萧县人，副教授，博士，主要从事真菌资源及其利用研究。E-mail:xinyianhui@163.com

时间:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.021

Q939.97

A

1671-9387(2015)03-0205-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.021.html