吴旭锦，朱小甫

(咸阳职业技术学院 畜牧兽医研究所，动物疫病分子生物学诊断实验室，陕西 咸阳 712000)

新城疫国标RT-PCR诊断方法的优化与应用

吴旭锦，朱小甫

(咸阳职业技术学院 畜牧兽医研究所，动物疫病分子生物学诊断实验室，陕西 咸阳 712000)

【目的】 对新城疫(ND)国标RT-PCR诊断方法进行改进和优化，建立一种灵敏度高、特异性好、能直接从组织病料中进行目的基因检测的NDV套式RT-PCR(nest RT-PCR，RT-nPCR)方法。【方法】 根据GenBank上发表的新城疫病毒基因序列，设计并合成了2对引物，通过筛选最佳RT-nPCR条件，建立了NDV RT-nPCR检测方法。通过灵敏性试验、特异性试验、病料检测对比试验等，验证了RT-nPCR方法的可靠性和适用性。【结果】 建立的NDV RT-nPCR方法灵敏度较高，检测的极限为5.6×10-5ng/L；特异性较好，仅能从NDV中扩增到目的条带。从6份疑似组织病料中能直接检测出4份阳性结果，而国标方法均未检出，病毒分离鉴定结果与优化后的RT-nPCR方法符合率达100%。【结论】 建立了一种灵敏度高、特异性好、可直接从组织病料中快速检测NDV核酸的RT-nPCR方法。

新城疫；诊断方法；RT-PCR

新城疫(Newcastle disease，ND)是严重危害禽类的病毒性传染病之一，是我国农业部法定的一类动物疫病[1]。ND的病原是新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)，属副黏病毒科、腮腺炎病毒属(Rubulavirus)，有囊膜，具有能刺激宿主产生抑制红细胞凝集素及病毒中和抗体的抗原成分[2]。病毒核酸类型为单股、负链、不分节段的RNA。在NDV基因组上依次排列着NP、P、M、F、HN和L基因，分别编码核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶(HN)和大分子蛋白(L)，其中F、HN蛋白与NDV的致病性密切相关[3-4]。

目前，虽然国内养禽场对新城疫的预防极为重视，但新城疫的流行仍频繁发生，损失巨大[5-6]。因此，及早诊断、尽快控制新城疫，对减少经济损失有重要意义。在我国国家标准《新城疫诊断技术》(GB/T 16550-2008)中，诊断方法有临床诊断、病毒分离鉴定、血凝-血凝抑制试验(HA-HI试验)和反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)等[7]。其中临床诊断只能初步诊断，确诊方法中的病毒分离鉴定、血凝-血凝抑制试验均需进行病毒分离，耗时较长，不适应临床快速诊断的要求。RT-PCR技术具有灵敏度高、特异性好、快速准确的优点，十分适合养殖场快速定性诊断的需要。但是，在笔者实际应用国标RT-PCR方法进行诊断时发现，直接将采集的棉拭子、肺脏或脾脏等处理后提取RNA，然后进行RT-PCR得到的却是阴性结果，而通过鸡胚接种传1～3代后，用尿囊液提取RNA进行RT-PCR得到的是阳性结果，提示国标方法的灵敏度不够，样品中病毒含量较低时可能无法有效扩增。研究发现，套式PCR能够大幅度提高基因扩增的灵敏度，即使在模板浓度较低的情况下也能高效扩增目的基因[8]。为此，本研究对诊断NDV的国标RT-PCR进行了优化改进，提高其检测灵敏度，以期在临床中能够直接从组织病料中有效扩增目的片段，达到快速诊断的目的。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 病 毒 新城疫病毒SXWN株由咸阳职业技术学院动物疫病分子生物学诊断实验室分离鉴定。参考毒株中，传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡痘病毒(POX)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)和禽脑脊髓炎病毒(AEV)均为商品疫苗毒株，禽流感H9亚型病毒(H9 AIV)由动物疫病分子生物学诊断实验室分离保存。

1.1.2 病 料 本实验室采集或鸡场送检的组织病料包括发病鸡肺脏、脾脏、气管，分别来自陕西渭南、咸阳和西安地区鸡场，共计6份，研磨处理，12 000 r/min离心10 min，收集上清液并于-70 ℃保存备用。

1.1.3 鸡 胚 SPF鸡胚由陕西杨凌绿方生物工程有限公司提供。

1.1.4 试 剂 TRIzol Reagent、DNAzol Reagent为Invitrogen公司产品，AMV反转录酶(10 U/μL)、RNA酶抑制剂(40 U/μL)、DEPC处理水、rTaq酶(5 U/μL)、dNTP(各成分均为10 mmol/L)等均购自生工生物工程(上海)有限公司，NDV标准阳性血清、阴性血清和NDV标准抗原均为中国兽医药品监察所产品。

1.1.5 引物设计与合成 参考GB/T 16550-2008，根据GenBank上发表的LaSota株(GenBank登录号：JF950510)、Mukteswar株(GenBank登录号：JF950509)、NDV08-004株(GenBank登录号：FJ794269)的F基因序列，设计并合成了2对引物：NDV-F1.5′-CTCTACTAAGCTGGAGAA-3′(4327-4344，为相对于LaSota株基因组位置，以下同)，NDV-R1.5′-CTTGTTTAAAGCGGGA-3′(5239-5224)；NDV-F2.5′-ATGGGCYCCAGAYCTTCTAC-3′(4544-4563),NDV-R2.5′-CTGCCACTGCTAGTTGTGA-TAATCC-3′(5078-5054)。引物预期扩增片段长度535 bp，由生工生物工程(上海)有限公司合成，均用DEPC处理水稀释到20 μmol/L。

1.2 方 法

1.2.1 NDV RNA的提取和第一链cDNA的合成 取NDV SXWN株尿囊液250 μL，按照TRIzol Reagent试剂说明提取总RNA，空气中自然干燥。在核酸干燥过程中，按照以下体系配制反转录反应液：DEPC处理水10.5 μL，上游引物NDV-F1 1.0 μL，dNTP 4.0 μL，5×AMV Buffer 4.0 μL，AMV 0.25 μL，RNA酶抑制剂 0.25 μL，总体积20.0 μL。核酸干燥后用配制好的反转录反应液充分溶解核酸，于42 ℃水浴中反转录90 min，取出后在核酸蛋白测定仪上测定cDNA的含量。

1.2.2 NDV RT-nPCR方法灵敏性试验 将cDNA溶液进行10倍梯度稀释至109倍，分别以各稀释度cDNA溶液作为模板进行PCR扩增。第1次扩增按照以下反应体系进行：cDNA 2.0 μL，超纯水16.25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl22.0 μL，dNTP 1.0 μL，NDV-F1、NDV-R1各0.5 μL，rTaq酶0.25 μL，总体积25.0 μL。条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 50 s，54 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共进行30个循环；最后72 ℃充分延伸10 min。取第1次扩增产物2.0 μL作为模板进行第2次扩增，体系同第1次扩增，引物为NDV-F2/NDV-R2。条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30个循环；最后72 ℃充分延伸10 min。取5.0 μL第2次扩增产物，进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统照相并观察。

1.2.3 NDV RT-nPCR方法特异性试验 提取NDV、IBV、IBDV、AEV和H9亚型AIV等RNA病毒的核酸并反转录获得cDNA；按照DNAzol Reagent试剂说明提取POX和ILTV等DNA病毒的DNA模板，用NDV-F1/NDV-R1、NDV-F2/NDV-R2引物对分别进行第1次和第2次PCR扩增，对PCR产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察并照相。

1.2.4 病料中NDV的检测对比 用以上建立的检测方法和国标方法对收集的6份组织病料进行检测，同时用SXWN株尿囊液作为对照。

1.2.5 病料中NDV的分离鉴定与RT-nPCR检测结果的对比 分别取6份组织病料上清液200 μL，接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔，弃去24 h内死亡鸡胚，以后每隔6 h照蛋1次，收集死亡鸡胚尿囊液。同样方法连续传代3次，收集第3代尿囊液用国标HA-HI方法进行病毒鉴定，鉴定后与建立的NDV RT-nPCR检测结果进行比较。

1.2.6 盲传3代鸡胚尿囊液的国标RT-PCR检测 提取6份盲传3代的尿囊液总RNA，用国标RT-PCR方法进行检测。

2 结果与分析

2.1 NDV RT-nPCR检测方法的灵敏性

经过测定，SXWN株尿囊液RNA提取后反转录cDNA含量为560 ng/L，将其按照10倍梯度进行稀释，分别进行nPCR。从图1可知，所建立的方法能够扩增出107倍稀释的cDNA，即检测的极限为5.6×10-5ng/L。表明此方法灵敏度高，可以作为NDV检测方法。

2.2 NDV RT-nPCR检测方法的特异性

用所建立的方法对NDV、IBV、IBDV、POX、ILTV、AEV和H9亚型AIV阳性毒cDNA/DNA进行扩增，结果发现，仅有NDV扩增出了535 bp的预期目的条带，其他6种毒的扩增结果均为阴性(图2)，提示所建立的方法特异性好。

图2 NDVF基因RT-nPCR检测方法特异性试验结果
M.DNA Marker(100～1 000 bp)；1.NDV；2.IBV;3.IBDV;4.POX;5.ILTV;6.AEV;7.H9 AIV
Fig.2 Specialization test for NDV RT-nPCR

2.3 RT-nPCR与国标RT-PCR方法对病料中NDV的检测结果比较

提取收集的6份疑似感染NDV的组织病料总RNA，分别用建立的RT-nPCR方法与国标RT-PCR方法进行检测，同时用NDV SXWN株尿囊液进行参照，结果见图3。从图3可以看出，RT-nPCR方法在6份组织病料中有4份扩增出了目的条带，参照的阳性毒尿囊液同样扩增出了535 bp的条带；而国标RT-PCR方法对6份组织病料的扩增均未出现目的条带，仅有参照的阳性毒尿囊液扩增出了535 bp的条带。试验结果显示，与国标方法相比，本试验建立的检测方法能够从病料中有效扩增目的条带。

2.4 病料中NDV的分离鉴定与RT-nPCR检测结果的比较

3次传代后，用建立的RT-nPCR方法诊断的4份阳性病料尿囊液HA效价达到28～210，而2份阴性病料尿囊液HA效价均为20，提示阴性病料中不存在具有血凝性的病毒。将4份有HA效价的尿囊液进行HI试验，结果表明，标准NDV阳性血清能有效抑制4份尿囊液的HA效价，提示分离到的确为NDV，与建立的RT-nPCR方法的检测结果完全一致，符合率达100%。

2.5 国标RT-PCR方法对盲传3代鸡胚尿囊液的检测结果

经过检测，国标方法从6份尿囊液中检测出了4份阳性，2份阴性(图4)，检测结果与本试验建立的RT-nPCR方法完全一致。

3 讨 论

新城疫是一种世界范围流行的传染病，目前仍是家禽重大疫病之一，在我国防控新城疫仍然任重道远。对于病毒性传染病，及早进行病原诊断是防控的重点措施之一[9]。新城疫的病原诊断方法主要有病毒分离鉴定、HA-HI试验、荧光抗体技术和RT-PCR。病毒分离鉴定、HA-HI试验是可靠的确诊手段，但最大的缺点是需要进行鸡胚接种传代，耗时较长，不能快速诊断。荧光抗体检测的优点是快速定性，缺点是灵敏度较低[10]。

随着分子生物学研究资料的逐渐丰富，NDV基因序列不断登录GenBank，为设计特异性引物、建立RT-PCR诊断方法提供了丰富资料[11-13]。国标《新城疫诊断技术》(GB/T 16550-2008)中也规定了RT-PCR方法。但是在实际应用中，笔者发现直接处理发病鸡组织病料后用国标RT-PCR法诊断结果不甚理想，很多临床病例初次诊断均为阴性，但只要将组织样品处理上清液接种鸡胚1～3代，再次用国标RT-PCR法诊断即转为阳性，用HA-HI试验也证实分离到了NDV。该结果提示国标RT-PCR法灵敏度不足，在组织病料中病毒含量很低的情况下，将反转录产物直接用于PCR扩增很难扩增到目的片段，目前尚未见到对国标方法进行改进优化的公开报道。为了克服这一缺点，本研究采用了套式PCR技术，在国标方法目的片段外再设计1对外扩引物，以增加PCR扩增的特异性和敏感性，建立了NDV RT-nPCR检测方法。灵敏度试验结果表明，优化方法检测的极限为5.6×10-5ng/L；特异性试验结果提示该方法对常见的其他6种禽病毒检测均为阴性，只能从NDV中扩增出目的条带。在对6份组织病料的检测对比中，原国标方法检测结果均为阴性，改进的RT-nPCR方法检测出4份为阳性结果。将此6份病料接种于鸡胚传3代，通过HA-HI试验证实，4份阳性病料均分离到了NDV，2份阴性病料则未分离到NDV，RT-nPCR方法检测结果与病毒分离结果相符率达100%。以上结果证明，建立的RT-nPCR方法灵敏度高、特异性好，能直接应用于组织病料检测，达到快速、准确诊断的目的，节约了大量时间，为生产上迅速防控新城疫疫情提供了一种优异的技术手段。另外，扩增产物为F基因片段，包含了NDV强弱毒鉴别序列位点，经过基因测序后可为区分毒株致病性的强弱提供参考。

[1] Saif Y M.禽病学 [M].苏敬良，高 福，索 勋,译.11版.北京:中国农业版社,2005.

Saif Y M.Poultry science [M].Su J L,Gao F,Suo X,translation.11th edition.Beijing:China Agriculture Press,2005.(in Chinese)

[2] Barbezange C,Jestin V.Molecular study of the quasispecies evolution of a typical pigeon paramyxovirus type 1 after serial passages in pigeons by contact [J].Avian Pathol,2005,34:111-122.

[3] Aldous E W,Alexander D J.Detection and differentiation of Ne-wcastle disease virus(avian paramyxovirus type 1) [J].Avain Pathlol,2001,30(2):117-128.

[4] Panda R,Huang Z H,Elankumaran S,et al.Role of fusion protein cleavage site in the virulence of Newcastle disease viruse [J].Microbial Pathogenesis,2004,36:1-10.

[5] 崔治中.我国家禽新城疫流行现状 [J].中国家禽,2002,24(4):4-6.

Cui Z Z.Newcastle disease of poultry epidemic situation [J].Chinese Poultry,2002,24(4):4-6.(in Chinese)

[6] 李 曦,符 芳,崔尚金,等.自主活动鸟类禽流感及新城疫的生态学与流行病学调查分析 [J].中国预防兽医学报,2006,28(3):327-331.

Li X,Fu F,Cui S J,et al.Epidemiology surveillance and analysis on avian influenza and newcastle disease of free-living birds in Guangxi and Hubei province of China in 2004 [J].Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine,2006,28(3):327-331.(in Chinese)

[7] 刘华雷,吴艳涛,王志亮,等.GB/T 16550-2008 新城疫诊断技术 [S].北京:中国标准出版社,2008.

Liu H L,Wu Y T,Wang Z L,et al.GB/T 16550-2008 Newcastle disease diagnostic techniques [S].Beijing:China Standard Press,2008.(in Chinese)

[8] Kant A,Koch G,Van Roozelaar,et al.Differentiation of virulent and non-virulent strains of Newcastle disease virus within 24 hours by polymerise chain reaction [J].Avian Pathology,1997,26:837-849.

[9] 伏小平,张银田,胡永浩,等.西北地区鸡新城疫流行病学调查情况分析 [J].中国兽医杂志,2004,40(1):29-31.

Fu X P,Zhang Y T,Hu Y H,et al.Northwest epidemiological investigation of Newcastle disease [J].Chinese Journal of Veterinary Medicine,2004,40(1):29-31.(in Chinese)

[10] 杜景娇,薛 强,邹明强,等.新城疫检测技术的研究新进展 [J].中国畜牧兽医,2012,39(2):187-190.

Du J J,Xue Q,Zou M Q,et al.Research advance on Newcastle disease virus detection technology [J].China Animal Husbandry and Veterinary Medicine,2012,39(2):187-190.(in Chinese)

[11] 刘 禄,韦 平.禽新城疫快速鉴别诊断方法的建立 [J].中国家禽,2002,24(4):9-11.

Liu L,Wei P.Poultry rapid differential diagnosis of Newcastle disease establishment of method [J].Chinese Poultry,2002,24(4):9-11.(in Chinese)

[12] 宋长绪，刘福安.用PCR检测鸡NDV的初步试验 [J].中国兽医科技，1995,25(10):20.

Song C X,Liu F A.Preliminary test of detection chicken NDV by PCR [J].Chinese Journal of Veterinary Science and Technology,1995,25(10):20.(in Chinese)

[13] Cui S J,Fung Y W.Detection of Newcastle disease virus using nucleic acid sequence based amplification [J].Biologicals,2007,35(1):13-18.

Optimization and application of national standard based RT-PCR diagnostic technique for Newcastle disease

WU Xu-jin,ZHU Xiao-fu

(AnimalEpidemicDiseaseDiagnosticLaboratoryofMolecularBiology,InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,XianyangVocationalTechnicalCollege,Xianyang,Shaanxi712000,China)

【Objective】 Based on improvement and optimization of RT-PCR diagnostic technique for Newcastle disease,this study established a modified RT-PCR diagnostic technique (RT-nPCR),which was sensitive and specific for direct test of NDV from clinical tissue samples.【Method】 According to published GenBank NDV gene sequences,two pairs of primers were synthesized to detect NDV.The best conditions for the establishment of NDV RT-nPCR detection were obtained and sensitivity test,specificity test,direct tissue samples test and virus isolation test were carried out to verify the applicability and superiority of the RT-nPCR method.【Result】 The established method had high sensitivity with the detection limit of 5.6 ×10-5ng/L,and the objective band could be amplified only from NDV template.Using the RT-nPCR method,4 out 6 suspicious samples were detected positive,which was 100% in compliance with virus isolation method.On the contrary,the national standard RT-PCR did not identify any positive samples.【Conclusion】 A sensitive and specific RT-nPCR method for rapid NDV detection from clinical tissue samples was successfully established.

newcastle disease;diagnosis;RT-PCR

2013-11-01

咸阳市2011年科技计划项目(2011K04-12)

吴旭锦(1979-)，女，陕西西安人，副教授，博士，主要从事纳米药物开发和动物疫病分子病原学研究。

时间:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.028

S851.347.201

A

1671-9387(2015)03-0027-05

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.028.html